大腸桿菌表達(dá)純化服務(wù)-原核蛋白表達(dá)

  大腸桿菌表達(dá)是指通過(guò)基因克隆技術(shù)，將外源目的基因?qū)�入表達(dá)菌株，使其在特定條件下進(jìn)行表達(dá)。與其他表達(dá)系統(tǒng)相比，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、目的基因表達(dá)水平高、培養(yǎng)周期短、抗污染能力強(qiáng)、更易于生長(zhǎng)和控制，有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具有各種特性的質(zhì)�？晒┻x擇等優(yōu)點(diǎn)。
  E.coli的乳糖操縱子（元）含Z、Y及A三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，分別編碼半乳糖苷酶、滲透酶和乙�；�轉(zhuǎn)移酶，此外還有一個(gè)操縱序列O、一個(gè)啟動(dòng)序列P及一個(gè)調(diào)節(jié)基因I。I基因編碼一種阻遏蛋白，后者與O序列結(jié)合，使操縱子（元）受阻遏而處于關(guān)閉狀態(tài)。在啟動(dòng)序列P上游還有一個(gè)分解（代謝）物基因激活蛋白（CAP）結(jié)合位點(diǎn)。由P序列、O序列和CAP結(jié)合位點(diǎn)共同構(gòu)成lac操縱子的調(diào)控區(qū)，三個(gè)酶的編碼基因即由同一調(diào)控區(qū)調(diào)節(jié)，實(shí)現(xiàn)基因產(chǎn)物的協(xié)調(diào)表達(dá)。
  在沒(méi)有乳糖存在時(shí)，lac操縱子（元）處于阻遏狀態(tài)。此時(shí)，I序列在PI啟動(dòng)序列操縱下表達(dá)的Lac阻遏蛋白與O序列結(jié)合，阻礙RNA聚合酶與P序列結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)。當(dāng)有乳糖存在時(shí)，lac操縱子（元）即可被誘導(dǎo)。在這個(gè)操縱子（元）體系中，真正的誘導(dǎo)劑并非乳糖本身。乳糖進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)β-半乳糖苷酶催化，轉(zhuǎn)變?yōu)楫惾樘�。后者作為一種誘導(dǎo)劑分子結(jié)合阻遏蛋白，使蛋白構(gòu)象變化，導(dǎo)致阻遏蛋白與O序列解離、發(fā)生轉(zhuǎn)錄。異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的作用與異乳糖相同，是一種作用很強(qiáng)的誘導(dǎo)劑，不被細(xì)菌代謝而十分穩(wěn)定，因此被實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用。

實(shí)驗(yàn)流程

　　1、原核表達(dá)載體構(gòu)建：目的基因克隆或目的基因合成；限制性內(nèi)切酶酶切骨架載體并純化；目的基因插入骨架載體；轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序鑒定；
　　2、轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株：針對(duì)不同的表達(dá)載體選擇合適的表達(dá)菌株，將目的載體轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株內(nèi)，例如：BL21 (DE3)；
　　3、蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件摸索：優(yōu)化目的蛋白表達(dá)條件：IPTG濃度，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間，誘導(dǎo)表達(dá)溫度等；SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)；
　　4、擴(kuò)大培養(yǎng)：選擇更佳的誘導(dǎo)表達(dá)條件擴(kuò)大培養(yǎng)物；
　　5、制備表達(dá)菌株蛋白提取物：超聲波破碎菌體或者高壓破碎菌體；
　　6、目的蛋白的純化：親和純化；SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳、Western Blot檢測(cè)。
 

　　服務(wù)周期短；
　　目的蛋白純度高；
　　目的蛋白可溶性高；
　　多種表達(dá)菌株以及載體可供選擇；
　　團(tuán)隊(duì)經(jīng)驗(yàn)豐富