利用SrCas12a實現(xiàn)精準(zhǔn)快速的分枝桿菌屬檢測和分化

分枝桿菌是一大類細(xì)菌，廣泛存在于自然環(huán)境中。其中一些種類會導(dǎo)致人類患上嚴(yán)重疾病，是傳染病感染中的主要死亡原因。臨床上結(jié)核分枝桿菌（MTB）和牛分枝桿菌（MB）是導(dǎo)致人類結(jié)核�。═B）的主要原因；鳥分枝桿菌（MAV）和細(xì)胞內(nèi)分枝桿菌（MI）是導(dǎo)致人類肺部疾病的常見原因。非結(jié)核桿菌和人類結(jié)核桿菌感染后的癥狀相識，極易導(dǎo)致誤診。所以需要準(zhǔn)確的物種鑒養(yǎng)，輔助制定有效的結(jié)核病和非結(jié)合桿菌感染的治療策略。細(xì)菌培養(yǎng)仍然是鑒定分支桿菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)方法，培養(yǎng)周期漫長，需要約6周左右的時間。因此，需要開發(fā)精準(zhǔn)快速的鑒定方法至關(guān)重要。
 

發(fā)表在Clinica Chimica Acta的一篇文章中通過基于RPA結(jié)合CRISPR-Cas12a的等溫擴增技術(shù)，準(zhǔn)確鑒定臨床分離株中的8種分枝桿菌菌株；對各種靶向分枝桿菌的檢測限為1-100拷貝/反應(yīng)，特異性和靈敏度高；反應(yīng)速度快，一個小時內(nèi)可以獲得結(jié)果；快速、便攜且用戶友好，非常適合資源匱乏的臨床環(huán)境。

工作示意圖：步驟包括（1）使用RPA反應(yīng)擴增部分rpoB基因（2）用Cas12a切割靶DNA，然后反式切割熒光團-淬滅劑ssDNA-報告基因，（3）通過藍/白光透射儀觀察釋放的熒光信號，肉眼可見。

材料和方法

(1)細(xì)菌菌株和臨床樣品的制備：提取8個參考菌株DNA 和熱滅活分枝桿菌，包括結(jié)核分枝桿菌菌株 ATCC27294、牛分枝桿菌菌株 ATCC19210、膿腫分枝桿菌 ATCC19977、鳥分枝桿菌菌株 ATCC700898、偶發(fā)分枝桿菌菌株 ATCC6841、堪薩斯分枝桿菌菌株 ATCC12478、戈登分枝桿菌菌株 ATCC14470、細(xì)胞內(nèi)分枝桿菌菌株 ATCC13950 和共 80 個臨床分離株。小量制備試劑盒提取和純化 DNA。

(2)靶向基因引物和gRNA設(shè)計：從ATCC和 NCBI 獲得來自每個分枝桿菌物種的 rpoB 基因核苷酸序。設(shè)計靶向 rpoB 基因的 RPA 引物并進行比對。試劑盒制備gRNA。

(3)重組酶聚合酶擴增 （RPA）：使用 TwistAmp Basic 試劑盒（TwistDx，UK）。總體積為 10 μL 、含有 5.9 μL 含凍干反應(yīng)的再水化緩沖液、0.48 μL 10 μM 正向和反向引物以及 2.14 μL 蒸餾水。然后，加入 1 μL 基因組 DNA 模板和 0.5 μL 280 mM MgOAC，然后在 39 °C 下孵育 30 分鐘，然后在 75 °C 下熱滅活 5 分鐘。蒸餾水用作 NTC（無模板對照）。

(4)CRISPR-Cas12a 檢測方法：1.5 μL 500 nM gRNA、0.75 μL 330 nM  SrCas12a、1 μL 6 μM 熒光團淬滅基團報告基因（FQ 報告基因）（6FAM-AGGACCCGTATTCCCA-BHQ1）、1.5 μL 10x NEBuffer 2.0 反應(yīng)緩沖液和 1 μL RPA 產(chǎn)物。用蒸餾水將總體積調(diào)節(jié)至 15 μL。將反應(yīng)物在 39 °C 下孵育 15 分鐘。使用 BluPAD Dual LED 藍/白光透射儀 （BIO-HELIX，臺灣） 觀察熒光信號。使用智能手機相機捕獲熒光讀數(shù)，并使用 ImageJ（NIH，美國）自動調(diào)整。對于熒光定量，通過 Applied Biosystems™ QuantStudio™ qPCR Systems（Thermo Fisher Scientific，美國）測量熒光。每個實驗重復(fù) 3 次。

(5)評估特異性并確定參考菌株的檢測限:通過對 7 種分枝桿菌屬的交叉反應(yīng)性測試來評估 gRNA 的特異性。檢測限 （LOD） 一式三份，將每個標(biāo)準(zhǔn) DNA 靶標(biāo)從 10 個靶標(biāo)中連續(xù)稀釋 10 倍5拷貝數(shù)/μL 低至 1 拷貝/μL 作為 MyTRACK 檢測的模板。通過檢測基因組 DNA 濃度最低的試管中的熒光信號來確定 LOD。對各種靶向分枝桿菌的檢測限為 1 - 100 拷貝/反應(yīng)。


尚睿生物簡介：
武漢尚睿生物科技有限公司是一家專業(yè)從事新一代分子檢測技術(shù)和產(chǎn)品研發(fā)的科技型企業(yè)。公司位于武漢國家生物產(chǎn)業(yè)基地——光谷生物城，擁有配置完善的研發(fā)實驗室、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)車間、嚴(yán)格的質(zhì)控體系以及專業(yè)的培訓(xùn)服務(wù)，為客戶提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和專業(yè)的技術(shù)服務(wù)奠定了堅實的基礎(chǔ)。

公司與國內(nèi)外科研院所專家合作開發(fā)四大技術(shù)平臺：
（1）微流控芯片技術(shù)和設(shè)備、芯片研發(fā)生產(chǎn)平臺；
（2）AirPOC分子POCT檢測儀、試劑研發(fā)生產(chǎn)平臺；
（3）CAS蛋白酶原料制備、CRISPR技術(shù)研發(fā)生產(chǎn)平臺；
（4）熒光定量PCR檢測試劑、質(zhì)控品、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研發(fā)生產(chǎn)平臺。公司基于四大平臺開發(fā)的產(chǎn)品包括微流控芯片、儀器，分子POCT試劑、儀器，CRISPR電化學(xué)檢測試劑盒，快速檢測箱等多種形式；產(chǎn)品涉及生物育種、動物疫病監(jiān)測、食品安全、海關(guān)檢疫等多個領(lǐng)域，可為養(yǎng)殖企業(yè)、食品企業(yè)、政府實驗室、政府監(jiān)管部門提供優(yōu)質(zhì)、可靠的產(chǎn)品、檢測方案和服務(wù)。同時，公司與政府實驗室和高校開展全方位合作，開發(fā)新的檢測方法、起草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等。

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