外切-β-1，4-葡聚糖酶（C1）/纖維二糖苷酶活性測定試劑盒使用說明書

注   意 ：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：
C1（EC3.2.1.91）存在于細菌、真菌和動物體內，是纖維素酶系的組份之一，C1催化多聚糖鏈的末端非還原端釋放出纖維二糖和葡萄糖。
 
測定原理：
采用3,5－二硝基水楊酸法測定C1催化微晶纖維素降解產(chǎn)生的還原糖的含量。
 
需自備的儀器和用品：
酶標儀/可見分光光度計、水浴鍋、離心機、可調式移液器、96孔板/微量石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
 
試劑的組成和配制：
提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；
試劑一：液體6mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：液體25mL×1瓶，4℃保存；
 
樣品測定的準備： 
1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
3、血清（漿）樣品：直接檢測。
 
測定步驟：

• 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至540nm，蒸餾水調零。

2、加樣表（在EP管中依次加入下列試劑）：

試劑名稱（μL）	測定管	對照管
樣本	10	10
試劑一	100
蒸餾水		100

混勻，37℃準確水浴2h

試劑二

200

200

混勻， 90℃水浴10min（蓋緊，防止水分散失），冷卻后，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中，測540nm下吸光值A，計算ΔA=A測定管-A對照管。每個測定管需設一個對照管。
 
C1活性計算
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
1、標準條件下測定回歸方程為y = 6.4078x - 0.0673；x為標準品濃度（mg/mL），y為吸光值。
2、血清（漿）C1活力的計算
單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。
C1活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反總]÷V樣÷T=14.305×(ΔA+0.0673)
3、細胞、細菌和組織中C1活力的計算
（1）按照蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。
C1活力(μg /min/mg prot)=[ [1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反總]÷(V樣×Cpr) ÷T
=14.305×(ΔA+0.0673) ÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算
單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。
C1活力(μg /min /g鮮重)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反總]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T
=14.305×(ΔA+0.0673) ÷W
（3）按細菌或細胞密度計算
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。
C1活力(μg /min /10⁴ cell)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反總]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T
=0.0286×(ΔA+0.0673)
1000：1mg/mL=1000ug/mL；V反總：反應體系總體積，0.11mL； V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，120 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。
 
b.用96孔板測定的計算公式如下
1、標準條件下測定回歸方程為y = 3.2039x - 0.0673；x為標準品濃度（mg/mL），y為吸光值。
2、血清（漿）C1活力的計算
單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。
C1活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V反總]÷V樣÷T=28.61×(ΔA+0.0673)
3、細胞、細菌和組織中C1活力的計算
（1）按照蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。
C1活力(μg /min/mg prot)=[ [1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V反總]÷(V樣×Cpr) ÷T
=28.61×(ΔA+0.0673) ÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算
單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。
C1活力(μg /min /g鮮重)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V反總]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T
=28.61×(ΔA+0.0673) ÷W
 
（3）按細菌或細胞密度計算
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。
C1活力(μg /min /10⁴ cell)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V反總]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T
=0.057×(ΔA+0.0673)
1000：1mg/mL=1000ug/mL；V反總：反應體系總體積，0.11mL； V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，120 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。