生物指示劑最短培養(yǎng)時(shí)間（MIT）測(cè)定全新方案介紹

在此背景下，美國(guó)醫(yī)療器械促進(jìn)協(xié)會(huì)于2008年成立特設(shè)委員會(huì)展開專項(xiàng)研究，其發(fā)表的兩項(xiàng)成果為MIT測(cè)定奠定了理論基礎(chǔ)。本文將詳細(xì)闡述基于這些成果提出的創(chuàng)新MIT測(cè)定方法。

一、最短培養(yǎng)時(shí)間（MIT）測(cè)定方法
本研究深入分析了10,000多種暴露于不同滅菌過(guò)程的生物指示劑的生長(zhǎng)時(shí)間，研究范圍涵蓋多種生物指示劑配置，包括自含式生物指示劑和傳統(tǒng)孢子條，孢子載體選用紙和不銹鋼材質(zhì)。同時(shí)，選取嗜熱土芽孢桿菌和萎縮芽孢桿菌這兩種最常用的細(xì)菌內(nèi)孢子作為研究對(duì)象。

科德角國(guó)際丨BI-O.K.™ 蒸汽滅菌自含式生物指示劑（左）
BI-O.K.™ 環(huán)氧乙烷自含式滅菌生物指示劑（右）

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格控制生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并選擇121℃、132℃、134℃和135℃的濕熱滅菌，以及環(huán)氧乙烷（EO）氣體、過(guò)氧化氫（H2O2）蒸汽和二氧化氯（ClO2）氣體等多種滅菌工藝。這些滅菌工藝不僅是常用的滅菌手段，還具有不同的致死機(jī)制，如H2O2介導(dǎo)的能量轉(zhuǎn)移、烷基化和氧化等，從而確保了研究的全面性和代表性。

研究對(duì)不同組別的生物指示劑在以下三種條件下進(jìn)行評(píng)估：
1、未暴露：作為對(duì)照組。
2、暴露于各種滅菌過(guò)程：使30%-80%的生物指示劑檢測(cè)結(jié)果為非無(wú)菌（即生長(zhǎng)呈陽(yáng)性）。在此條件下，部分生物指示劑無(wú)菌，部分非無(wú)菌，符合FDA CDRH協(xié)議的要求。
3、根據(jù)特定公式計(jì)算的時(shí)間暴露：
依據(jù)ISO11138-1、ISO14161和美國(guó)藥典中公布的計(jì)算存活時(shí)間（CST）公式確定暴露時(shí)間。
所有暴露后的細(xì)菌培養(yǎng)物均進(jìn)行培養(yǎng)，直至觀察到非無(wú)菌結(jié)果，或最長(zhǎng)培養(yǎng)7天，通過(guò)培養(yǎng)基渾濁、pH指示劑顏色變化等證據(jù)判斷非無(wú)菌結(jié)果。

二、關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)：揭示生物指示劑生長(zhǎng)規(guī)律
通過(guò)生長(zhǎng)時(shí)間研究，獲得了一系列與確定最短培養(yǎng)時(shí)間（MIT）密切相關(guān)的重要發(fā)現(xiàn)：
1、無(wú)論滅菌過(guò)程類型、致死機(jī)制以及生物指示劑上的孢子種類如何，生物指示劑生長(zhǎng)時(shí)間范圍近似正態(tài)分布。
2、暴露后的生物指示劑上存活孢子的數(shù)量與觀察到的生長(zhǎng)時(shí)間呈反比。即存活孢子數(shù)量較多的生物指示劑，其生長(zhǎng)時(shí)間相對(duì)較短；反之，存活孢子數(shù)量較少的生物指示劑，生長(zhǎng)時(shí)間則較長(zhǎng)。
3、約1.1%的生物指示出現(xiàn)生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)現(xiàn)象，這種現(xiàn)象在所有研究的滅菌過(guò)程中均有發(fā)生，且僅在滅菌暴露產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)區(qū)結(jié)果時(shí)才會(huì)發(fā)生。
4、在CST條件下暴露的生物指示劑無(wú)生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)情況，且生長(zhǎng)時(shí)間更快更穩(wěn)定。

三、舊方法局限：FDA CDRH協(xié)議的爭(zhēng)議
FDA CDRH協(xié)議難以被廣泛接受，主要原因在于缺乏測(cè)試結(jié)果來(lái)支持該方法及其接受標(biāo)準(zhǔn)。該協(xié)議要求進(jìn)行三次滅菌暴露，每次使用100個(gè)生物指示劑，且需保證30%-80%的生物指示劑測(cè)試結(jié)果為非無(wú)菌；同時(shí)還規(guī)定縮短培養(yǎng)時(shí)間（RIT）與7天培養(yǎng)時(shí)間結(jié)果的相關(guān)性必須大于97%。然而，批評(píng)者認(rèn)為，30%-80%的數(shù)值設(shè)定及相關(guān)性要求缺乏合理依據(jù)，國(guó)際社會(huì)普遍質(zhì)疑其選擇標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性，但始終未有相關(guān)原理或測(cè)試結(jié)果能夠?qū)Υ诉M(jìn)行證明。

從微生物暴露于滅菌過(guò)程的效應(yīng)來(lái)看，在僅有兩種可能結(jié)果（無(wú)菌或非無(wú)菌）的實(shí)驗(yàn)條件下，部分生物指示劑可能僅有一個(gè)孢子存活，其他生物指示劑存活孢子數(shù)量較少。僅有一個(gè)孢子存活的生物指示劑，其孢子可能未受嚴(yán)重?fù)p壞或受到嚴(yán)重影響，這會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)時(shí)間的顯著差異。

根據(jù)泊松分布預(yù)測(cè)，當(dāng)滅菌暴露使50%的生物指示劑為非無(wú)菌時(shí)，約35個(gè)生物指示劑僅有一個(gè)孢子存活，其余15個(gè)有兩個(gè)及以上孢子存活，且僅有一個(gè)存活孢子的生物指示劑生長(zhǎng)時(shí)間大多處于較窄范圍，少數(shù)會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)。例如在濕熱和環(huán)氧乙烷滅菌過(guò)程中，分別僅有2/458（0.44%）和3/309（0.97%）個(gè)生物指示劑出現(xiàn)生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)的情況。

當(dāng)暴露條件導(dǎo)致的無(wú)菌比例較低時(shí)（如35%與75%相比），更易出現(xiàn)生長(zhǎng)時(shí)間較長(zhǎng)的生物指示劑。以35%的非無(wú)菌結(jié)果為例，每個(gè)暴露的生物指示劑平均存活孢子數(shù)為0.43，而75%非無(wú)菌結(jié)果時(shí)平均存活孢子數(shù)為1.39。隨著非無(wú)菌生物指示劑百分比降低，按比例來(lái)說(shuō)，更多無(wú)菌生物指示劑將僅有一個(gè)有活力的孢子。因此采用CST計(jì)算所規(guī)定的暴露時(shí)間內(nèi)處理生物指示劑，使存活孢子數(shù)量保持在較低水平，是開發(fā)可行MIT方法的重要前提。

四、新方法：基于CST的MIT測(cè)定方案
基于先前研究測(cè)試結(jié)果及數(shù)據(jù)分析，現(xiàn)提出確定生物指示劑最短培養(yǎng)時(shí)間（MIT）的新方法：
1、從三個(gè)批次中分別獲取至少100個(gè)由不同孢子作物生產(chǎn)的生物指示劑。
2、測(cè)定每個(gè)批次生物指示劑的D10值和孢子數(shù)量。
3、運(yùn)用公式計(jì)算每批生物指示劑的存活時(shí)間（公式：CST=D10值×[log10初始孢子數(shù)-2]，單位：分鐘），該公式旨在使100%的生物指示劑檢測(cè)結(jié)果為非無(wú)菌。
4、在CST條件下，通過(guò)單獨(dú)的電阻計(jì)運(yùn)行對(duì)每批生物指示劑進(jìn)行暴露處理。
5、采用生物指示劑制造商指定的回收方法（或指定的生長(zhǎng)培養(yǎng)基），并在規(guī)定的環(huán)境條件下操作。
6、持續(xù)培養(yǎng)，直至所有生物指示劑均檢測(cè)出非無(wú)菌結(jié)果，或培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到7天（若7天后仍未檢測(cè)出非無(wú)菌，則需重新確認(rèn)D10值和孢子總數(shù)）。
7、記錄所有生物指示劑的非無(wú)菌測(cè)試時(shí)間。
8、MIT為三個(gè)生物指示劑批次中出現(xiàn)非無(wú)菌結(jié)果的最長(zhǎng)時(shí)間。

在確定CST時(shí)，建議使用Holcomb-Spearman-Karber（微生物破壞定量檢測(cè)數(shù)據(jù)分析方法）方法計(jì)算D10值。該方法利用一系列滅菌暴露中的所有分?jǐn)?shù)陰性結(jié)果，計(jì)算“平均無(wú)菌時(shí)間”和相關(guān)的D10值。從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度來(lái)看，這種方法計(jì)算出的D10值更有可能是最準(zhǔn)確的，能夠提供最佳的D10值估計(jì)。

五、新方法：契合現(xiàn)代滅菌監(jiān)測(cè)需求
開發(fā)新的MIT測(cè)定方法需充分考慮滅菌過(guò)程監(jiān)測(cè)和控制方法的發(fā)展。早期濕熱滅菌器監(jiān)測(cè)手段有限，生物指示劑測(cè)試結(jié)果對(duì)確定滅菌工藝有效性至關(guān)重要。而如今，滅菌過(guò)程在工藝驗(yàn)證框架下進(jìn)行，現(xiàn)代滅菌器配備先進(jìn)監(jiān)測(cè)和控制系統(tǒng)，生物指示劑檢測(cè)結(jié)果從屬于記錄的物理/化學(xué)結(jié)果，即便生物指示劑全部滅活，若物理/化學(xué)要求不滿足，滅菌過(guò)程仍判定為不合格。

大量實(shí)驗(yàn)表明，未暴露與經(jīng)過(guò)滅菌處理的生物指示劑孢子萌發(fā)和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)存在差異，未暴露的生長(zhǎng)速度快、時(shí)間變化小，經(jīng)過(guò)滅菌處理的平均生長(zhǎng)時(shí)間長(zhǎng)、變化大。新提出的使用CST滅菌暴露的MIT方法，充分考慮了這種變異性，避免了“異常”結(jié)果的不當(dāng)影響。相比之下，F(xiàn)DA CDRH方案中30-80%的存活率窗口存在問(wèn)題，其縮短培養(yǎng)時(shí)間（RIT）的結(jié)果常受僅有單個(gè)孢子存活的生物指示劑異常結(jié)果主導(dǎo)，缺乏穩(wěn)健性和可重復(fù)性。

預(yù)計(jì)本文提出的MIT方法不會(huì)降低生物指示劑在監(jiān)測(cè)和控制滅菌過(guò)程中的有效性，反而能提供可重復(fù)確定生物指示劑生長(zhǎng)時(shí)間的可靠方法為生物指示劑在現(xiàn)代滅菌監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用提供更科學(xué)、準(zhǔn)確的技術(shù)支持。