羧酸酯酶（CarE）活性測定試劑盒使用說明書

 
注   意 ：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
哺乳動物CarE，也稱脂族酯酶（aliesterase），廣泛分布于組織和器官，屬于絲氨酸水解酶家族。CarE催化含酯鍵、酰胺鍵和硫酯鍵的內(nèi)源性與外源性物質(zhì)水解，但不能催化水解乙酰膽堿及其類似物。CarE參與脂質(zhì)運輸和代謝，并且與多種藥物、環(huán)境毒物以及致癌物的解毒和代謝有關(guān)，有機磷農(nóng)藥可結(jié)合并且抑制CarE活性。
 
測定原理：
CarE能催化乙酸-1-萘酯生成萘酯，固籃顯色；在450 nm光吸收增加速率，計算CarE活性。
 
自備儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、低溫離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。
 
試劑組成和配置：
試劑一：液體×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體15mL×2瓶， 4℃保存；
試劑三：粉劑×2支， 4℃保存，臨用前取1支試劑三，加0.6ml無水乙醇充分溶解；
試劑四：粉劑×2支，-20℃保存，臨用前取1支試劑四，加少量試劑二溶解；
工作液配制：臨用前配制，向1瓶試劑二中，加入溶解后的試劑三和試劑四各1支，充分溶解，過濾，4℃避光保存，可用1周。
 
粗酶液提�。�
細菌、細胞樣品制備
收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每200萬細菌或細胞加入400μL試劑一，超聲波破碎細菌或細胞（功率20％，超聲3s，間隔10s，重復30次）；12000g 4℃離心30min，取上清液待測。
2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿；12000g 4℃離心30min，取上清液待測。
3、液體：直接測定
 
測定操作：
1. 分光光度計/酶標儀預熱30min，調(diào)節(jié)波長到450 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二置于37℃水浴中預熱30 min。
3. 空白管：取微量玻璃比色皿/96孔板，依次加入5μL蒸餾水和200μL試劑二，迅速混勻，于450nm處測定3min內(nèi)吸光值變化，第10s吸光值記為A1，第190s吸光值記為A2�！鰽空白管=A2-A1
4. 測定管：取微量玻璃比色皿/96孔板，依次加入5μL上清液和200μL試劑二，迅速混勻，于450nm處測定3min內(nèi)吸光值變化，第10s吸光值記為A3，第190s吸光值記為A4。△A測定管=A4-A3
 
注意：空白管只需測定一次。
 
CarE活性計算公式：
a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
1 組織中CarE活性

• 按蛋白濃度計算

CarE活性單位定義：每mg組織蛋白在37℃反應體系中每分鐘催化吸光值增加1定義為1個酶活單位。
 CarE酶活(U/mg prot)= (△A測定管-△A空白管) ×V反總÷(Cpr×V樣)÷T= 13.67×(△A測定管-△A空白管)÷Cpr

• 按樣本鮮重計算

CarE活性單位定義：每g組織在37℃反應體系中每分鐘催化吸光值增加1定義為1個酶活單位。
CarE酶活(U/g 鮮重)= (△A測定管-△A空白管) ×V反總×（V樣總÷V樣）÷W÷T
=13.67×(△A測定管-△A空白管)÷W
2 細菌或細胞中CarE活性
CarE活性單位定義：每1萬個細菌或細胞在37℃反應體系中每分鐘催化吸光值增加1定義為一個CarE活性單位。
CarE酶活(U/10⁴ cell)= (△A測定管-△A空白管) ×V反總×（V樣總÷V樣）÷細胞密度（10⁴ cell/mL）÷T=13.67×(△A測定管-△A空白管)÷細胞密度（10⁴ cell/mL）
3. 液體中CarE活性
CarE活性單位定義：每毫升樣品在37℃反應體系中每分鐘催化吸光值增加1定義為1個酶活單位。
CarE酶活(U/mL )= (△A測定管-△A空白管) ×V反總÷V樣÷T
=13.67×(△A測定管-△A空白管)
V反總：反應體系總體積，205μL=2.05×10^-4L；V樣總：上清液總體積，1 mL；V樣：加入上清液體積(mL)，0.005 mL；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量（g）；T：反應時間（min），3min。

b. 使用96孔板測定的計算公式如下
1 組織中CarE活性

• 按蛋白濃度計算

CarE活性單位定義：每mg組織蛋白在37℃反應體系中每分鐘催化吸光值增加1定義為1個酶活單位。
 CarE酶活(U/mg prot)= (△A測定管-△A空白管) ×V反總÷(Cpr×V樣)÷T= 13.67×(△A測定管-△A空白管)÷Cpr

• 按樣本鮮重計算

CarE活性單位定義：每g組織在37℃反應體系中每分鐘催化吸光值增加1定義為1個酶活單位。
CarE酶活(U/g 鮮重)= (△A測定管-△A空白管) ×V反總×（V樣總÷V樣）÷W÷T
=13.67×(△A測定管-△A空白管)÷W
2 細菌或細胞中CarE活性
CarE活性單位定義：每1萬個細菌或細胞在37℃反應體系中每分鐘催化吸光值增加1定義為一個CarE活性單位。
CarE酶活(U/10⁴ cell)= (△A測定管-△A空白管) ×V反總×（V樣總÷V樣）÷細胞密度（10⁴ cell/mL）÷T=13.67×(△A測定管-△A空白管)÷細胞密度（10⁴ cell/mL）
3. 液體中CarE活性
CarE活性單位定義：每毫升樣品在37℃反應體系中每分鐘催化吸光值增加1定義為1個酶活單位。
CarE酶活(U/mL )= (△A測定管-△A空白管) ×V反總÷V樣÷T
=13.67×(△A測定管-△A空白管)
V反總：反應體系總體積，205μL=2.05×10^-4L；V樣總：上清液總體積，1 mL；V樣：加入上清液體積(mL)，0.005 mL；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量（g）；T：反應時間（min），3min。