哮喘模型

1.小鼠過敏性哮喘模型
BALB/c小鼠于第0天和第14天分別腹腔注射0.1mL/只OVA液(0.2 mg/mL)和DBP溶液（0.5 mg/kg），第21~23天連續(xù)3天以0.5%的OVA溶液霧化激發(fā)，每天于上午下午固定時間霧化2次，每次20min。霧化過程中觀察小鼠一般行為變化，最后一次霧化結(jié)束后24小時，小鼠摘眼球取血，取支氣管肺泡灌洗液( Bronchial Alveolar Lavage, BALF )及肺組織。
一般行為學(xué)觀察  觀察小鼠在霧化過程中是否出現(xiàn)撓臉、毛發(fā)豎立、呼吸急促、煩躁不安、大小便失禁等現(xiàn)象。
血中Eos計數(shù)    最后一次霧化激發(fā)結(jié)束24h后，小鼠摘眼球取血，獲得血液后立即取出20 μl與380μl 嗜酸性粒細(xì)胞稀釋液混勻，利用細(xì)胞計數(shù)板于光學(xué) 顯微鏡下進(jìn)行Eos計數(shù)。
血清中IgE測定   將獲得的血液靜置2h后，離心，3500 rpm，15min，取血清，按IgE ELISA試劑盒說明書進(jìn)行測定，并通過樣本總蛋白含量進(jìn)行結(jié)果校正。
BALF細(xì)胞分類計數(shù)  將小鼠仰臥位固定，打開胸腔后，結(jié)扎右肺及左側(cè)肺上葉。分離并暴露氣管，用適宜針頭進(jìn)行氣管插管，以預(yù)冷PBS反復(fù)灌洗肺組織（0.5 mL/次，共兩次），收集BALF，低溫離心( 3500 rpm，10min )，取上清，保存于-20℃待測。細(xì)胞沉淀用0.2 mL預(yù)冷PBS重懸，吹打均勻后取10 μl于細(xì)胞計數(shù)板上在光學(xué)顯微鏡下計細(xì)胞總數(shù)，剩余細(xì)胞懸液涂片，用快速瑞姬氏染液染色，顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類計數(shù)。
BALF中IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IFN-γ的測定  將獲得的BALF上清根據(jù)相關(guān)細(xì)胞因子檢測試劑盒的說明書進(jìn)行各指標(biāo)定量檢測，測定結(jié)果經(jīng)總蛋白含量校正。
肺組織中IL-4和IFN-γ的測定  將右側(cè)肺組織用預(yù)冷的PBS研磨得15 % 組織勻漿，低溫離心，3500 rpm，15min，取上清按照 ELISA 測定試劑盒的操作步驟進(jìn)行IL-4和IFN-γ測定，并通過樣本總蛋白定量來進(jìn)行校正。
肺組織HE及PAS染色  剪取左肺上葉，置10%中性福爾馬林中固定，石蠟包埋，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE及PAS染色，鏡下觀察肺組織炎性細(xì)胞浸潤及黏性蛋白增生情況。
 
2.枸櫞酸誘發(fā)豚鼠咳嗽實(shí)驗(yàn)
取體重200-260 g豚鼠，雌雄各半，置于500 mL的觀察室內(nèi)，以恒定壓力噴入17.5%的枸櫞酸，噴霧1 min，觀察并記錄豚鼠在5 min之內(nèi)的咳嗽潛伏期和咳嗽次數(shù)，將咳嗽潛伏期≤10 s或≥120 s，以及5 min內(nèi)咳嗽次數(shù)≤10次或者≥50次的豚鼠全部剔除。預(yù)選合格的豚鼠經(jīng)體重隨機(jī)分層分組，即模型組、咳必清組、各劑量給藥組，每組6只。各組連續(xù)灌胃給藥7天，每天一次，模型組豚鼠灌以等體積生理鹽水。末次給藥后1 h，按上述篩選條件引咳豚鼠，觀察并記錄各豚鼠咳嗽潛伏期及5 min內(nèi)咳嗽次數(shù)，并與模型組比較。
 
3.氨水誘發(fā)小鼠咳嗽實(shí)驗(yàn)
18-22 g ICR小鼠，雌雄各半，按體重隨機(jī)分層分組，即模型組、咳必清組、各劑量給藥組。各組連續(xù)灌胃給藥7天，每天一次，模型組小鼠灌以等體積生理鹽水。末次給藥后1 h，將小鼠置于一倒置的容積為500 mL，內(nèi)置一棉球的燒杯中，在向棉球上滴加0.4 mL濃氨水時開始計時，觀察并記錄小鼠咳嗽潛伏期和3min內(nèi)咳嗽次數(shù)，并與模型組比較。
 
4.大鼠急性咽炎模型
清潔級SD大鼠，雌雄各半，用喉頭噴霧器于大鼠咽部噴體積分?jǐn)?shù)15％氨水， 每次噴 3 撳，相當(dāng)于6μl 15%氨水停留在大鼠咽部。每天上、下午各 1 次，連續(xù) 3 d，造成急性咽炎模型；每日觀察記錄各組動物外觀狀態(tài)，并觀察動物咽部情況，包括黏膜形態(tài)、色澤等。
觀測指標(biāo)：
一般狀態(tài)觀察：觀察記錄大鼠的飲水、飲食、活動、體重、精神狀態(tài)及被毛等情況，并觀察動物咽部情況， 包括黏膜形態(tài)、色澤等。
血常規(guī)檢測：檢測白細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞等百分含量
檢測血清炎性細(xì)胞因子IL-1b、IL-6、TNF-a的水平：末次給藥24后，腹主動脈取血，靜止2h，離心（3000 rpm，10 min），取上清，-20℃保存，采用ELISA方法檢測血清中IL-1b、IL-6、TNF-a的水平。
咽部病理組織學(xué)觀察：大鼠腹主動脈取血處死后，立即取咽部黏膜及其下組織， 進(jìn)行肉眼觀察，并用體積分?jǐn)?shù) 10％中性福爾馬林溶液固定，進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。
 
5.化痰實(shí)驗(yàn)-小鼠酚紅排痰
小鼠雌雄各半，按體重隨機(jī)分為5組，分別為空白組、陽性藥組（鹽酸氨溴索）、低、中、高劑量組，每組10只�？诜�液各劑量組小鼠灌胃給以不同劑量藥物，給藥體積為0.1 mL/10g，空白組小鼠給以等體積蒸餾水，連續(xù)給藥7天，1次/天；陽性藥組小鼠于第5-7天灌胃給予鹽酸氨溴索口服溶液30 mg/kg，1次/天。末次給藥30 min后，各組小鼠腹腔注射5 %酚紅溶液500 mg/kg，30 min后，斷頸處死動物，仰位固定。
剪開頸部正中皮膚，分離氣管，于喉頭下部將平頭7號針頭插入氣管內(nèi)約0.3 cm，絲線結(jié)扎固定，用1 mL注射器吸取5% NaHCO3溶液0.8 mL推注入氣管內(nèi)，反復(fù)推抽3次以灌洗氣道，共灌洗3次，每次收集0.5 mL灌洗液，合并，約1.5 mL入小試管，離心（2000 r/min， 10 min），取上清液于546 nm處測OD值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算各小鼠氣管內(nèi)酚紅濃度（μg/mL）。
酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法: 分析天平準(zhǔn)確稱量一定量酚紅，加5% NaHCO3溶液溶解，配制成酚紅含量為20 μg/mL的溶液，然后梯度稀釋成15、10、5、3、1、0.7、0.5 μg/mL溶液，酶標(biāo)儀檢測不同濃度酚紅溶液在546 nm處OD值，以濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。