貼壁細(xì)胞293細(xì)胞到貨脫落的處理方法
293系列細(xì)胞到貨又雙叒叕脫落？
別慌！3招拯救你的“玻璃心”細(xì)胞！
（中喬新舟細(xì)胞10X ）
293細(xì)胞作為貼壁細(xì)胞，但部分亞系（如293T、293F）因基因修飾或培養(yǎng)習(xí)慣，貼壁能力較弱。長(zhǎng)途運(yùn)輸導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，貼壁不穩(wěn)。發(fā)貨活細(xì)胞T25瓶到貨常常會(huì)出現(xiàn)以下情況：
一、 遇到這樣該怎么處理?
1、若細(xì)胞已漂浮，別急著倒掉。
2、建議收到細(xì)胞后放培養(yǎng)箱靜止2-4h后觀察細(xì)胞是否再次恢復(fù)貼壁。
3、如果貼壁可去除培養(yǎng)基，輕柔pbs洗一次，加入0.25%胰酶作用2-3min鏡下觀察細(xì)胞變圓,手掌心拍打瓶尾震動(dòng)細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞成單個(gè)，就可加含10%FBS完全培養(yǎng)基終止消化，輕柔吹打4-6次至細(xì)胞全成單個(gè)懸浮細(xì)胞即可。12-24小時(shí)后會(huì)有90%以上細(xì)胞會(huì)貼壁。
4、如果細(xì)胞沒(méi)有恢復(fù)貼壁，可以收集培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)液體離心1000轉(zhuǎn)5min收集細(xì)胞沉淀，接種到新培養(yǎng)瓶，可提高血清濃度到15%。T25培養(yǎng)瓶建議加7ml完全培養(yǎng)基。
5、必要時(shí)使用多聚賴氨酸、纖連蛋白進(jìn)行包被，促進(jìn)細(xì)胞的延展和貼壁。
二、消化不透徹的后果
以下是客戶T25瓶細(xì)胞密度達(dá)到80%左右進(jìn)行傳代，1：3傳代，加入1ml的0.25%胰酶，第二天的細(xì)胞結(jié)果圖：
1、 圖片能明顯看到細(xì)胞抱團(tuán)嚴(yán)重，延展性不好 ，這是由于細(xì)胞在消化過(guò)程中沒(méi)有消化透徹，細(xì)胞脫落后沒(méi)有分散成單個(gè)細(xì)胞就終止消化導(dǎo)致。
2、 很多老師擔(dān)心細(xì)胞消化過(guò)度，損傷細(xì)胞，考慮到細(xì)胞既然都消化脫落了，那就可以終止消化了。
3、 其實(shí)胰酶是比較溫和的，相對(duì)外界的一次性吸管吹打，移液槍吹打。
三、如何讓您的293細(xì)胞乖乖“趴平”，狀態(tài)拉滿！
1、消化： 消化脫落后室溫延長(zhǎng)1-2min,手掌心拍打瓶尾觀察細(xì)胞脫落情況，震動(dòng)分散細(xì)胞，顯微鏡下觀察分散情況，加含10%FBS完全培養(yǎng)基終止消化。（T25瓶1ml胰酶3-5ml終止液）
2、減少吹打次數(shù)：在凍存或傳代過(guò)程中，細(xì)胞沉淀用手指彈松分散開(kāi)再進(jìn)行下一步操作，若要吹打建議用寬口移液槍頭輕柔吹散，并減少次數(shù)。避免機(jī)械損傷。
3、降低胰酶濃度：若把控不好消化時(shí)間，改用低濃度胰酶（0.05%）+ EDTA，（可用0.25%胰酶+pbs稀釋）消化時(shí)間控制在3-6分鐘。
四、優(yōu)化微環(huán)境，讓細(xì)胞“穩(wěn)如泰山”
1、溫柔復(fù)蘇，給細(xì)胞“緩沖期”
· 37℃水浴解凍后，逐滴加入預(yù)溫培養(yǎng)基（1mL凍存液+3-5mL培養(yǎng)基），減少滲透壓沖擊。
· 1000 rpm × 5分鐘，避免細(xì)胞團(tuán)機(jī)械損傷。去除培養(yǎng)基，用手指彈松細(xì)胞團(tuán)塊后進(jìn)行補(bǔ)液分瓶。
· 24小時(shí)不擾動(dòng)，接種后靜置培養(yǎng)，別手癢急著觀察細(xì)胞。
2、貼壁性不好，如何改善？
· 用0.1%明膠（4h以上或過(guò)夜）或多聚賴氨酸（10 μg/mL，4h以上或過(guò)夜）預(yù)處理，增強(qiáng)細(xì)胞吸附。
· 優(yōu)先用優(yōu)質(zhì)胎牛血清（FBS），批次差異大的可提前測(cè)試促貼壁效果。提高血清濃度，刺激細(xì)胞生長(zhǎng)。
· 或可添加1-2 mM 谷氨酰胺或非必需氨基酸（NEAA），提供額外營(yíng)養(yǎng)支持。
293細(xì)胞雖“嬌氣”，但只要掌握好消化技巧+溫柔操作+優(yōu)化環(huán)境的技巧，就能讓它“穩(wěn)如老狗”！趕緊試試這些方法，讓你的實(shí)驗(yàn)不再被細(xì)胞脫落“卡脖子”！
別慌！3招拯救你的“玻璃心”細(xì)胞！
（中喬新舟細(xì)胞10X ）
293細(xì)胞作為貼壁細(xì)胞，但部分亞系（如293T、293F）因基因修飾或培養(yǎng)習(xí)慣，貼壁能力較弱。長(zhǎng)途運(yùn)輸導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，貼壁不穩(wěn)。發(fā)貨活細(xì)胞T25瓶到貨常常會(huì)出現(xiàn)以下情況：
一、 遇到這樣該怎么處理?
1、若細(xì)胞已漂浮，別急著倒掉。
2、建議收到細(xì)胞后放培養(yǎng)箱靜止2-4h后觀察細(xì)胞是否再次恢復(fù)貼壁。
3、如果貼壁可去除培養(yǎng)基，輕柔pbs洗一次，加入0.25%胰酶作用2-3min鏡下觀察細(xì)胞變圓,手掌心拍打瓶尾震動(dòng)細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞成單個(gè)，就可加含10%FBS完全培養(yǎng)基終止消化，輕柔吹打4-6次至細(xì)胞全成單個(gè)懸浮細(xì)胞即可。12-24小時(shí)后會(huì)有90%以上細(xì)胞會(huì)貼壁。
4、如果細(xì)胞沒(méi)有恢復(fù)貼壁，可以收集培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)液體離心1000轉(zhuǎn)5min收集細(xì)胞沉淀，接種到新培養(yǎng)瓶，可提高血清濃度到15%。T25培養(yǎng)瓶建議加7ml完全培養(yǎng)基。
5、必要時(shí)使用多聚賴氨酸、纖連蛋白進(jìn)行包被，促進(jìn)細(xì)胞的延展和貼壁。
二、消化不透徹的后果
以下是客戶T25瓶細(xì)胞密度達(dá)到80%左右進(jìn)行傳代，1：3傳代，加入1ml的0.25%胰酶，第二天的細(xì)胞結(jié)果圖：
1、 圖片能明顯看到細(xì)胞抱團(tuán)嚴(yán)重，延展性不好 ，這是由于細(xì)胞在消化過(guò)程中沒(méi)有消化透徹，細(xì)胞脫落后沒(méi)有分散成單個(gè)細(xì)胞就終止消化導(dǎo)致。
2、 很多老師擔(dān)心細(xì)胞消化過(guò)度，損傷細(xì)胞，考慮到細(xì)胞既然都消化脫落了，那就可以終止消化了。
3、 其實(shí)胰酶是比較溫和的，相對(duì)外界的一次性吸管吹打，移液槍吹打。
三、如何讓您的293細(xì)胞乖乖“趴平”，狀態(tài)拉滿！
1、消化： 消化脫落后室溫延長(zhǎng)1-2min,手掌心拍打瓶尾觀察細(xì)胞脫落情況，震動(dòng)分散細(xì)胞，顯微鏡下觀察分散情況，加含10%FBS完全培養(yǎng)基終止消化。（T25瓶1ml胰酶3-5ml終止液）
2、減少吹打次數(shù)：在凍存或傳代過(guò)程中，細(xì)胞沉淀用手指彈松分散開(kāi)再進(jìn)行下一步操作，若要吹打建議用寬口移液槍頭輕柔吹散，并減少次數(shù)。避免機(jī)械損傷。
3、降低胰酶濃度：若把控不好消化時(shí)間，改用低濃度胰酶（0.05%）+ EDTA，（可用0.25%胰酶+pbs稀釋）消化時(shí)間控制在3-6分鐘。
四、優(yōu)化微環(huán)境，讓細(xì)胞“穩(wěn)如泰山”
1、溫柔復(fù)蘇，給細(xì)胞“緩沖期”
· 37℃水浴解凍后，逐滴加入預(yù)溫培養(yǎng)基（1mL凍存液+3-5mL培養(yǎng)基），減少滲透壓沖擊。
· 1000 rpm × 5分鐘，避免細(xì)胞團(tuán)機(jī)械損傷。去除培養(yǎng)基，用手指彈松細(xì)胞團(tuán)塊后進(jìn)行補(bǔ)液分瓶。
· 24小時(shí)不擾動(dòng)，接種后靜置培養(yǎng)，別手癢急著觀察細(xì)胞。
2、貼壁性不好，如何改善？
· 用0.1%明膠（4h以上或過(guò)夜）或多聚賴氨酸（10 μg/mL，4h以上或過(guò)夜）預(yù)處理，增強(qiáng)細(xì)胞吸附。
· 優(yōu)先用優(yōu)質(zhì)胎牛血清（FBS），批次差異大的可提前測(cè)試促貼壁效果。提高血清濃度，刺激細(xì)胞生長(zhǎng)。
· 或可添加1-2 mM 谷氨酰胺或非必需氨基酸（NEAA），提供額外營(yíng)養(yǎng)支持。
293細(xì)胞雖“嬌氣”，但只要掌握好消化技巧+溫柔操作+優(yōu)化環(huán)境的技巧，就能讓它“穩(wěn)如老狗”！趕緊試試這些方法，讓你的實(shí)驗(yàn)不再被細(xì)胞脫落“卡脖子”！
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