PROTAC小分子化合物蛋白降解技術的原理和應用
PROTAC 是一種雜合雙功能小分子化合物，結構中含有兩種不同配體，一個是泛素連接酶 E3 配體，另一個是與細胞中目標靶蛋白結合的配體，兩個配體之間通過 Linker 相連，從而形成“三體”聚合物——靶蛋白配體-Linker-E3 配體。然后通過 E3 連接酶給靶蛋白加上泛素化標簽，啟動細胞內強大的泛素化水解過程，通過泛素-蛋白酶體途徑特異性地降解靶蛋白。
泛素-蛋白酶體途徑
細胞中的很多信號通路是通過泛素-蛋白酶體途徑選擇性降解某些關鍵調控蛋白來實現(xiàn)調控的。細胞內每時每刻都有數(shù)以千計的蛋白泛素化過程在進行,這種對特定蛋白高度特異的識別機制主要是由 E3 泛素連接酶決定的。
泛素-蛋白酶體途徑（ubiquitin-proteasome pathway, UPP）：是細胞內蛋白降解的主要途徑，參與細胞內 80% 以上蛋白質的降解。泛素分子在一系列酶作用下，將細胞內的蛋白質分類，從中選出靶蛋白分子，對靶蛋白進行特異性修飾的過程，形成靶蛋白多聚泛素鏈。這些酶包括泛素激活酶（E1），泛素結合酶（E2）、泛素連結酶（E3）等。這一過程是一個三酶級聯(lián)反應。靶蛋白被泛素（多肽）標記，然后被蛋白酶體識別和降解。通過這樣一個需要消耗能量的過程，細胞以高度特異方式對不需要的蛋白進行降解。值得一提的是，泛素化過程也是可逆的，泛素可被去泛素化酶（Deubiquitinase, DUB）從泛素鏈上去除，形成反向調節(jié)。
泛素化在蛋白質的代謝、調節(jié)和降解中起重要作用，蛋白質泛素化是生物體內一種常見的翻譯后修飾，同時參與細胞周期、凋亡、分化等幾乎一切生命活動的調控。泛素化與腫瘤、心血管、自身免疫等疾病的發(fā)病密切相關。
泛素分子(Ubiquitin)：是一種由 76 個氨基酸組成的小蛋白。具有高度保守的序列且存在于所有已知的真核生物體中。主要功能是標記需要分解掉的蛋白質，使其被蛋白酶體降解。泛素鏈與蛋白底物的結合形成被蛋白酶體降解的識別信號。單獨的泛素本身并沒有任何生物功能，只是一種分子標記蛋白，發(fā)揮作用必須在 ATP 提供能量的前提下依靠泛素途徑的相關酶類及蛋白酶體。
蛋白酶體 (Proteasome)：26S 蛋白酶體是 ATP 依賴型蛋白水解復合體，由 2 個 19S 調節(jié)亞單位，1 個 20S 核心亞單位， 和 11S 調節(jié)因子構成；組成一種桶狀結構，2 個 19S 亞單位位于桶狀結構的兩端，識別多聚泛素化蛋白并使其去折疊。20S 為催化亞單位，位于兩個 19S 亞單位的中間，其活性部位處于桶狀結構的內表面，可避免細胞環(huán)境的影響。20S 有胰蛋白酶、糜蛋白酶和谷氨酰樣肽水解活性，可以裂解大多數(shù)的肽鍵。
PROTAC 相關產(chǎn)品
BI-3663 由 PTK2/FAK 抑制劑 BI-4464 與 Pomalidomide 衍生物通過 Linker 產(chǎn)生的PROTAC。能夠在低納摩爾濃度下誘導 PTK2 降解。
多樣化的 E3 連接酶
目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有 600 多種 E3 泛素連接酶復合體，下面介紹研究最熱的 2 種：von Hippel-Lindau (VHL) 型和 Cereblon (CRBN) 型。
Cullin蛋白Cullin (Cul) 家族可形成調節(jié)細胞周期的活性復合體。Cullin (Cul) 家族有 6 個成員蛋白Cul1， Cul2，Cul3, Cul4, Cul5, Cul7。
N 端有 Cul 重復結構 (Cul repeat, CR)
C 端有 Cul 同源區(qū) (Cul homology, CH) , Neddy8 修飾位點：轉錄后修飾。
第一種：Von Hippel-Lindau (VHL) 型 E3 泛素連接酶復合體
VHL 基因是一種抑癌基因,其蛋白產(chǎn)物 VHL 可與 ElonginB、ElonginC、Cullin2 蛋白組成 VBC (VHL-ElonginB/C-CUL2) 復合物,該復合物屬于 E3-泛素蛋白酶系統(tǒng)，介導人體內多種蛋白的降解。癌癥中 VHL 經(jīng)常發(fā)生突變，近 70% 的突變都是破環(huán)了 VHL 與 Elongin 的結合。
羥腦苷脂 (Cereblon, CRBN) 是一種具有離子蛋白酶活性的大腦相關蛋白，可與 DNA 損傷結合蛋白-1 (DDB1)、滯蛋白 4 (Cullin4, Cul4A 或 Cul4B) 和調節(jié)因子 Cullins 1 (RoC1) 相互作用形成功能牲 E3 泛素連接酶復合體 (CRBN-CRL4)，結合底物后通過泛素-蛋白酶體途徑進行蛋白水解。Cereblon也是免疫調節(jié)劑 (IMiD) 抗骨髓瘤作用的必需靶蛋白。Lenalidomide，和 Pomalidomide 等與 CRBN 結合時會招募新的底物，使其結合在 CRBN-CRL4 上，導致其泛素化和蛋白酶體依賴的降解增加。CRBN-CRL4 復合體對四肢的發(fā)育有重要作用。
Cullin 蛋白家族的其他成員也可形成不同的 E3 泛素連接酶復合體，如下圖：
PROTAC Linker
PEG 類
PROTAC Linker 25 is a polyethylene glycol(PEG)-based PROTAC linker.Alkyl/ether 類
PROTAC Linker 2 is a Alkyl/ether based PROTAC linker.
Alkyl-Chain 類PROTAC Linker 31 is a PROTAC linker, which refersto the Alkyl-Chain composition.
SNIPER
SNIPERs (specific and non-genetic inhibitor of apoptosis protein (IAP)-dependentprotein erasers ) 是一系列凋亡蛋白抑制因子 (IAP) 高效特異性抑制劑，可募集 IAP 泛素連接酶來實現(xiàn)靶向降解。SNIPER - Hijacking IAP 活性以誘導蛋白質降解。與招募von Hippel-Lindau 和 cereblon 泛素連接酶的嵌合分子不同，SNIPERs 可以同時降解 IAP (例如 cIAP1 和 XIAP) 以及目標靶蛋白。Bestatin 是一種氨肽酶抑制劑。其甲酯化合物（MeBS）可通過 Bestatin 結構端與 cIAP1 的 BIR3 結構域結合，激活 cIAP1 的 E3 泛素化連接酶活性，誘導 cIAP1 發(fā)生字泛素化，然后被蛋白酶體降解。所以，在 MeBS 通過 linker 連接不同靶蛋白的小分子抑制劑，可以得到多個基于 cIAP1 E3 泛素化連接酶的 PTOTAC。但是，由于 MeBS 可以誘導 cIAP1 自身發(fā)生泛素化降解，因此很多基于此技術得到的 PTOTAC 在降解目標靶蛋白的同時會泛素化降低 cIAP1，導致很大程度上限制了其降低靶蛋白的效率。
聰明的科學家們繼續(xù)對 Bestatin 做進一步的結構改造，發(fā)現(xiàn) Bestatin 的酰胺衍生物保留了與 cIAP1 的結合活性，且不會引起 cIAP1 的自身泛素化降解。如 SNIPER(ABL)-020，SNIPER(ABL)-044 等等。
E3 Ligase Ligand-Linker Conjugate
E3 Ligase Ligand-Linker Conjugate Kit 是一個超級豐富的 E3 配體和 Linker 組合試劑盒。里面是一系列合成的化合物，結合了 E3 Ligase 配體和 Linker。另外還提供了不同的類型的 E3 Ligase 配體和多樣化的 Linker 組合任君選擇。
PROTAC 優(yōu)勢1. 用量小，毒性低
2. 克服靶蛋白突變3. 避免過表達引起的耐藥
4. 選擇性高
5. 清除蛋白堆積
小 M 的小思考
鑒于大多數(shù)小分子抑制劑的可逆結合，通常需要較大的全身給藥濃度和持續(xù)暴露以確保足夠的抑制。在許多情況下，維持體內足夠高的藥物濃度具有挑戰(zhàn)性的。所以，通過小分子誘導的蛋白降解來消除引起疾病的異常蛋白質正在發(fā)展為研究的新策略。PROTAC 技術可能令現(xiàn)在還無法成藥的 80% 蛋白組被小分子藥物調控。PROTAC 小分子研究進展目前主要集中在可靶向的靶點上。未來潛力之一是要靶向傳統(tǒng)意義上不可靶向的靶點，比如轉錄因子、蛋白的骨架功能等。
