土壤的分子生物學(xué)特性介紹

在我們的實(shí)驗(yàn)室里，最難搞的樣品類(lèi)型之一就是土壤。在開(kāi)發(fā)提取土壤中微生物DNA、RNA的試劑盒和構(gòu)思提取方法的過(guò)程中，我們需要收集記錄大量各種類(lèi)型土壤的有機(jī)物含量、質(zhì)地、pH以及采集地。這些因素與土壤微生物含量息息相關(guān)，同樣地也影響著提取DNA、RNA的得率。

下文，我將介紹一些影響土壤DNA、RNA提取的關(guān)鍵問(wèn)題。想了解更多土壤中發(fā)現(xiàn)的有機(jī)物成分，請(qǐng)點(diǎn)擊這里（soil microbiology）

腐植酸(Humic substances）：

困擾提取土壤DNA和RNA的最大問(wèn)題是其中的腐植質(zhì)含量（腐植酸、黃腐酸等腐殖質(zhì)）。腐植酸由有機(jī)物降解形成（植物、微生物等殘�。�，并使得土壤呈黑顏色（苯醌基的分子結(jié)構(gòu)）（1）。腐植酸分子都含有羧基和酚基，分子量大小不一。分子間抱團(tuán)螯合成大分子多價(jià)陽(yáng)離子，使得其非常利于微生物和植物的再次吸收利用（2）。有關(guān)腐植質(zhì)更多詳細(xì)介紹，請(qǐng)點(diǎn)擊這里

因?yàn)楦�植酸、黃腐酸與DNA、RNA一樣都是大分子親水性陰離子聚合物，很容易在最后步驟跟核酸一起被抽提出來(lái)。所以最好在最終洗脫核酸前把他們?nèi)コ�掉�?/P>

IRT技術(shù)（Inhibitor Removal Technology）：

抑制因子去除技術(shù)是MO BIO從土壤樣品中去除多苯多酚腐殖質(zhì)的一項(xiàng)專(zhuān)利技術(shù)。該技術(shù)的工作原理是通過(guò)改變pH值先溶解后沉淀蛋白等大分子物質(zhì)。核酸在這個(gè)過(guò)程中不會(huì)被沉淀，從而分離去除掉抑制因子。該技術(shù)同樣適用于血液中的亞鐵血紅素和糞便樣品、皮膚中的黑色素、法醫(yī)樣品中染血衣服上的染料。

微生物細(xì)胞裂解（Lysis of microorganisms）:

去除抑制因子是困難的第一步，而裂解土壤中的微生物細(xì)胞則是第二步。否則沒(méi)法準(zhǔn)確描述土壤微生物結(jié)構(gòu)情況。機(jī)械裂解法可以快速有效地裂解土壤中的細(xì)菌和真菌。我們實(shí)驗(yàn)室更喜歡用Vortex Genie 2 ，因?yàn)樗�有比�?qiáng)力高速珠磨研磨機(jī)所沒(méi)有的優(yōu)勢(shì)。

宏基因組學(xué)（Doing metagenomics）?

使用渦旋儀(Vortex)最大的一個(gè)好處就是，它長(zhǎng)達(dá)10分鐘相對(duì)輕柔的作用力破碎細(xì)胞可以得到更大分子量的DNA。低速轉(zhuǎn)動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生很少的熱量，避免過(guò)多熱量積聚引起的DNA、RNA降解。配合使用MO BIO的裂解緩沖液，可以更大限度減少DNA、RNA的破損，保障核酸分子完整性。 裂解緩沖液也是IRT技術(shù)的一部分。宏基因組學(xué)要求大分子量DNA，故渦旋儀(Vortex)是最好的選擇。

節(jié)省經(jīng)費(fèi)？

渦旋儀體積小價(jià)格便宜，特別適合經(jīng)費(fèi)有限的實(shí)驗(yàn)室，也特別適合在野外搭建臨時(shí)實(shí)驗(yàn)室。渦旋儀重量輕，最多還能一次處理24個(gè)樣品。MO BIO 已經(jīng)開(kāi)發(fā)出一系列用在 Vortex Genie 2.上的適配器（Vortex adapters），適應(yīng)各種大小的Tube管。

更強(qiáng)的裂解?

渦旋儀和我們的其它溶液足可以裂解絕大部分生物體，而對(duì)于一些真菌孢子類(lèi)則需要更強(qiáng)力的裂解。對(duì)于這類(lèi)樣品，我們建議在渦旋振蕩前加入加熱步驟。就是加樣后在65℃~70℃孵育10-15min（4,5）。另一個(gè)可選方法是渦旋振蕩前反復(fù)多次凍融。這些加強(qiáng)的裂解足可以對(duì)付堅(jiān)硬的孢子、真菌細(xì)胞。

高速珠磨研磨機(jī)如何？

高速珠磨研磨機(jī)有時(shí)是對(duì)付堅(jiān)硬生物體的有效手段，但過(guò)高的速度會(huì)過(guò)分剪切DNA，產(chǎn)生的熱量也會(huì)加速RNA的降解。在我們的實(shí)驗(yàn)室里，通過(guò)凝膠電泳并沒(méi)有觀察到使用高速珠磨研磨機(jī)對(duì)DNA得率有所貢獻(xiàn)。反而Nanodrop 的分光光度計(jì)在260nm讀數(shù)偏高，意味著DNA破損嚴(yán)重。（核酸蛋白定量?jī)x）。使用平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)存活的細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)使用渦旋儀和Precellys出來(lái)的結(jié)果差不多。不過(guò)高速珠磨研磨機(jī)Precellys增加了植物和昆蟲(chóng)DNA的釋放，稀釋了微生物DNA所占的比例。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)該盡量避免。

總結(jié)：

在后面的文章里，將詳細(xì)介紹土壤DNA的提取方法，以及在使用Powersoil DNA Kit和RNA Powersoil Kit時(shí)提高得率和純度建議和技巧。

參考文獻(xiàn)：

• A. Piccolo (2002). "The Supramolecular structure of humic substances. A novel understanding of humus chemistry and implications in soil science". Advances in Agronomy 75: 57–134.
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• Evaluation of five commercial nucleic acid extraction kits for their ability to inactivate Bacillus anthracis spores and comparison of DNA yields from spores and spiked environmental samplesLeslie A. Dauphin, Benjamin D. MoserJournal of Microbiological Methods, Volume 76, Issue 1, January 2009, Pages 30-37