Orflo快速流式細胞儀助力新型基因編碼鈣指示劑的研究

鈣離子(Ca2+)是機體各項生理活動不可缺少的離子，是細胞內(nèi)重要且廣泛存在的第二信使。監(jiān)測活細胞內(nèi)鈣水平，對探究生物活動相關(guān)的信號機制及規(guī)律至關(guān)重要。傳統(tǒng)的合成鈣指示劑，使用方便、可靠性高、動態(tài)范圍廣、光譜化學(xué)特性多樣。經(jīng)過優(yōu)化的基因編碼鈣指示劑(GECIs)，在許多應(yīng)用中可與其效果相媲美，尤其是GECIs表達穩(wěn)定，可有效降低試劑成本，簡化分析過程，比合成鈣指示劑更有優(yōu)勢。

來自Janssen研發(fā)有限責(zé)任公司的Nyantsz Wu等人，構(gòu)建了一個穩(wěn)定表達GCaMP6s的克隆細胞系，并通過流式細胞儀(flow cytometry)和熒光成像(FLIPR)等技術(shù)，對熒光基因編碼鈣指示劑GCaMP6s與合成鈣指示劑fluo-4進行了性能比較，相關(guān)研究以“High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator”為題，發(fā)表在《Scientific Reports》上。

實驗中，采用美國Orflo公司的Moxi GO II流式細胞儀進行流式細胞實驗，通過488nm激發(fā)激光和525/45nm發(fā)射濾光片，配合PMT檢測熒光強度，采用Coulter法測定細胞大小，直徑小于9微米的細胞被認為是碎片，排除在計數(shù)數(shù)據(jù)之外。

 

首先，流式細胞實驗對GCaMP6s與fluo-4的熒光光譜進行分析，比較fluo-4標記293-F細胞與用pGP-CMV-GCaMP6s轉(zhuǎn)染 24小時的細胞的熒光強度（圖1. a-c）

圖1. 流式細胞實驗對數(shù)變換熒光強度直方圖. (a)未標記細胞，(b)瞬時表達pGP-CMV-GCaMP6s，(c)標記fu -4的細胞
（用緩沖液(紅色)或10μM鈣離子通道載體(藍色)處理細胞）

然后，基于共聚焦顯微鏡和流式細胞儀，對GCaMP6s與fluo-4分別處理的細胞內(nèi)鈣離子變化進行可視化分析（圖2）。

圖2. 用GCaMP6s(a-c)和fluo -4(d-f)分別標記的穩(wěn)定表達GluA 1o -γ4 293-F細胞共聚焦圖像和流式細胞術(shù)檢測結(jié)果(c,f)懸浮細胞流式細胞術(shù)熒光強度直方圖：CP-465022(紅色)，谷氨酸+ LY-395153(橙色)，鈣離子通道載體(藍色)

最后，對流式細胞實驗結(jié)果進行總結(jié)（表）。在每次實驗中，測量所有直徑大于9μm細胞的計數(shù)平均值(運行1,800-11,000個細胞)。數(shù)據(jù)以每次結(jié)果的平均值±標準差表示，實驗次數(shù)用括號表示。細胞處理為CP-465022 (FCP);谷氨酸+LY-395153 (FPAM);鈣離子通道載體 (Fiono)。ΔF為(FPAM -FCP)或(Fiono -FCP)。

 

通過流式細胞實驗可以直接比較兩種熒光指示劑的熒光強度。FLIPR（高通量實時熒光檢測）實驗測量大約10,000至20,000個細胞的總熒光強度，可以通過流式細胞儀測量大約10,000個細胞的算術(shù)平均值來模擬。研究人員發(fā)現(xiàn)，GCaMP6s標記的細胞在總熒光輸出上比fluo-4標記的細胞低，但足以在FLIPR實驗中提供穩(wěn)健的反應(yīng)。

作為一種新型的熒光基因編碼的鈣指示劑，GCaMP6s具有高親和力、高表達量，不需要額外的染料加載，降低試劑成本，在細胞內(nèi)Ca2+濃度變化的監(jiān)測上顯示出與fluo-4相當(dāng)?shù)膭討B(tài)范圍和響應(yīng)特性。此外，GCaMP6s還可以通過標準的分子生物學(xué)技術(shù)進行改造，以適應(yīng)特定的實驗需求。文章認為GCaMP6s是一個有前景的新型工具，作為合成鈣指示劑的替代品，可以用于各種細胞生物學(xué)和藥理學(xué)研究，尤其是在需要高通量篩選的現(xiàn)代藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域。

在這項研究中，Moxi GO II作為一個實驗工具，即開即用，操作簡便，對于實現(xiàn)快速、準確的細胞內(nèi)鈣離子水平檢測至關(guān)重要，對評估GCaMP6s這一遺傳編碼鈣指示劑的性能和應(yīng)用潛力具有重要意義。

 

美國Orflo Technologies公司將行業(yè)公認的細胞計數(shù)金標準——庫爾特原理(Coulter Principle)，與熒光流式檢測技術(shù)相結(jié)合，推出的新一代快速流式細胞儀——Moxi GO II，提供超準確的細胞計數(shù)、細胞活率檢測，以及超高分辨率的細胞粒徑測量。庫爾特原理對顆粒個體進行逐個三維測量，不但能準確測量顆粒的粒徑分布，更能進行粒子絕對數(shù)目和濃度的測量。由于檢測時不受激光衍射、散射因樣本顏色或濃度變化的影響，庫爾特原理所測粒徑大小更接近真實。

Moxi GO II快速流式細胞儀，采用庫爾特原理進行細胞計數(shù)和粒徑測量，同時采用488nm激光光源，結(jié)合兩個PMT通道，525/45nm通道和561nm/LP（或者646nm/LP，可根據(jù)需要更換），進行細胞活率、細胞凋亡、轉(zhuǎn)染效率、活性氧簇、線粒體膜電位等常規(guī)流式檢測。儀器設(shè)計小巧輕便，無需預(yù)熱，開機即用，預(yù)設(shè)程序，觸屏操控，運行后10秒即可給出測試結(jié)果，使用后也無需清潔維護。無論是經(jīng)驗豐富的流式專家，還是初試身手的實驗小白，Moxi Go II都可以助您輕松完成實驗。

美國Orflo Technologies公司是一家非常專業(yè)的細胞分析儀器研發(fā)和制造企業(yè)，擁有多項專利技術(shù)，產(chǎn)品以庫爾特原理的高精細胞計數(shù)儀和超快流式細胞儀為主。

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https://doi.org/10.1038/s41598-019-49070-8


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