PCR實驗中常見問題與PCR擴增產物分析方法
PCR所有實驗結果都有成功或失敗，實驗的失敗可能是應該出結果而沒有出，我們把它稱作假陰性，不該出結果而出了結果我們把它稱為假陽性。PCR實驗中最常見的問題就是假陰性和假陽性問題。下面對其詳細分析：
一、假陰性
出現(xiàn)假陰性結果最常見的原因是：Taq DNA聚合酶活力不夠，或活性受到抑制；引物設計不合理；提取的模板質量或數(shù)量不過關以及PCR系統(tǒng)欠妥當；循環(huán)次數(shù)不夠。所以在實驗中出現(xiàn)假陰性失敗時，首先在原來擴增的產物中再加入Taq DNA聚合酶、增加5-10次循環(huán)，一般都會獲得成功。如果沒有成功應檢查PCR擴增儀的溫度是否準確，采集標本是否有問題。為了防止假陰性的出現(xiàn)在選用Taq DNA聚合酶時，要注意用活力高質量好的酶。同時在提取PCR模板時，應特別注意防止污染抑制酶活性物質（如酚、氯仿）的存在。盡管Taq DNA聚合酶對模板純度要求不高，但也不允許有破壞性有機試劑的污染。PCR擴增的先決條件及特異性是引物與靶DNA良好的互補，尤其是要絕對保證引物的3′端與靶基因的互補。對變異較大的擴增對象，宜采用巢式（Nested）PCR或double PCR。在進行PCR操作時應注意Mg2+的濃度要合理。PCR反應的各溫度點的設置要合理。
二、假陽性
PCR結果的假陽性是對被檢測標本而言，而反應系統(tǒng)中所擴增的產物是真實的。因為PCR技術高度靈敏，極其微量的靶基因污染都會造成大量擴增，而造成結果判斷上的失誤，所以污染是PCR假陽性的主要根源。PCR的污染主要是標本間的交叉污染和擴增子的污染。出現(xiàn)假陽性結果的另一種可能是樣品中存在有靶基因的同源序列。為了避免因污染而造成的假陽性，PCR操作時要隔離不同操作區(qū)、分裝試劑、簡化操作程序，使用一次性吸頭。
PCR擴增產物的分析法：
PCR擴增DNA片段只是一個重要手段。擴增片段的檢測和分析才是目的，根據研究對象和目的的不同而采用不同的分析法。瓊脂糖凝膠電泳可幫助判斷擴增產物的大小，有助于擴增產物的鑒定，點雜交除可鑒定擴增產物外，還有助于產物的分型；Southern雜交分析可從非特異擴增產物中鑒定出特異產物的大小，增加檢測的特異性與敏感性，最近發(fā)展的一系列產物分析法（PCR-ELISA,PCR-EIA,PCR-OLA等）均有助于產物的精確分析。
1、凝膠電泳分析法
PCR產物可通過瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，以前者最常用，通過電泳可以判斷擴增產物的大小。在臨床檢測中，僅通過凝膠電泳判斷擴增片段大小即可滿足檢測的需要。通常制膠方法為100mlTBE加1.5g瓊脂糖在微波鍋內溶解，稍冷后倒入電泳槽。
電泳后，用溴化乙淀染色20min，然后用去離子水漂洗2次，每次15min，于UV燈下觀察結果并拍照。
凝膠電泳不僅可以鑒定產物的大小，檢測擴增的情況，還可以用來純化擴增產物。
2、點雜交
當擴增產物是多條帶時，用點雜交更合適。這種方法的基本過程是，首先將擴增的DNA固定到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，再用放射性或非放射性標記物標記的探針雜交。點雜交還有助于檢測突變DNA的突變類型，用于人類遺傳病診斷和某些基因的分型。放射性同位素32P標記的寡核苷酸探針檢測的敏感性、特異性和方法的可靠性均不容懷疑，對人們認識某些疾病與基因變異的關系起了很大的作用。但是，由于同位素不穩(wěn)定和放射性危害，不能常規(guī)用于臨床或法醫(yī)檢驗，用非放射性物質（生物素、熒光素和地高辛等）標記的寡核苷酸探針分析PCR產物以確定核酸序列變異則是一種簡便而安全的方法。非放射性標記物質穩(wěn)定性高，使用方便、安全、檢測速度快。
3、微孔板夾心雜交法
該法是通過一固定于微孔板的捕獲探針與PCR產物的某一區(qū)域特異雜交使產物間接地固定于微孔板上。然后，再用一生物素等非放射性標記物標記的檢測探針與產物的另一區(qū)域雜交，漂洗后顯色即可判斷結果，該法需要兩個雜交過程來檢測一個產物，因此，其特異性較一次雜交的檢測法高。該法已用于HBV的檢測，其敏感度可達5個HBv DNA分子。此法的敏感性和特異性與PCR 32P探針的Southern雜交法相當。但PCR微孔板夾心雜交法操作簡便、快速、避免了同位素標記探針的危害，顯色反應類似于臨床常規(guī)應用的ELISA,適于臨床實驗室常規(guī)應用。
4、PCR-ELISA法
本法避免了電泳和雜交的步驟，適于常規(guī)ELISA記數(shù)儀檢測。因為5'端修飾后仍可進行常規(guī)PCR擴增特異靶序列。因此，可以通過修飾一個引物的5′端使其攜帶便于PCR產物固定的功能基因，而通過另一引物5′-端的修飾使產物便于檢測。
一、假陰性
出現(xiàn)假陰性結果最常見的原因是：Taq DNA聚合酶活力不夠，或活性受到抑制；引物設計不合理；提取的模板質量或數(shù)量不過關以及PCR系統(tǒng)欠妥當；循環(huán)次數(shù)不夠。所以在實驗中出現(xiàn)假陰性失敗時，首先在原來擴增的產物中再加入Taq DNA聚合酶、增加5-10次循環(huán)，一般都會獲得成功。如果沒有成功應檢查PCR擴增儀的溫度是否準確，采集標本是否有問題。為了防止假陰性的出現(xiàn)在選用Taq DNA聚合酶時，要注意用活力高質量好的酶。同時在提取PCR模板時，應特別注意防止污染抑制酶活性物質（如酚、氯仿）的存在。盡管Taq DNA聚合酶對模板純度要求不高，但也不允許有破壞性有機試劑的污染。PCR擴增的先決條件及特異性是引物與靶DNA良好的互補，尤其是要絕對保證引物的3′端與靶基因的互補。對變異較大的擴增對象，宜采用巢式（Nested）PCR或double PCR。在進行PCR操作時應注意Mg2+的濃度要合理。PCR反應的各溫度點的設置要合理。
二、假陽性
PCR結果的假陽性是對被檢測標本而言，而反應系統(tǒng)中所擴增的產物是真實的。因為PCR技術高度靈敏，極其微量的靶基因污染都會造成大量擴增，而造成結果判斷上的失誤，所以污染是PCR假陽性的主要根源。PCR的污染主要是標本間的交叉污染和擴增子的污染。出現(xiàn)假陽性結果的另一種可能是樣品中存在有靶基因的同源序列。為了避免因污染而造成的假陽性，PCR操作時要隔離不同操作區(qū)、分裝試劑、簡化操作程序，使用一次性吸頭。
PCR擴增產物的分析法：
PCR擴增DNA片段只是一個重要手段。擴增片段的檢測和分析才是目的，根據研究對象和目的的不同而采用不同的分析法。瓊脂糖凝膠電泳可幫助判斷擴增產物的大小，有助于擴增產物的鑒定，點雜交除可鑒定擴增產物外，還有助于產物的分型；Southern雜交分析可從非特異擴增產物中鑒定出特異產物的大小，增加檢測的特異性與敏感性，最近發(fā)展的一系列產物分析法（PCR-ELISA,PCR-EIA,PCR-OLA等）均有助于產物的精確分析。
1、凝膠電泳分析法
PCR產物可通過瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，以前者最常用，通過電泳可以判斷擴增產物的大小。在臨床檢測中，僅通過凝膠電泳判斷擴增片段大小即可滿足檢測的需要。通常制膠方法為100mlTBE加1.5g瓊脂糖在微波鍋內溶解，稍冷后倒入電泳槽。
電泳后，用溴化乙淀染色20min，然后用去離子水漂洗2次，每次15min，于UV燈下觀察結果并拍照。
凝膠電泳不僅可以鑒定產物的大小，檢測擴增的情況，還可以用來純化擴增產物。
2、點雜交
當擴增產物是多條帶時，用點雜交更合適。這種方法的基本過程是，首先將擴增的DNA固定到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，再用放射性或非放射性標記物標記的探針雜交。點雜交還有助于檢測突變DNA的突變類型，用于人類遺傳病診斷和某些基因的分型。放射性同位素32P標記的寡核苷酸探針檢測的敏感性、特異性和方法的可靠性均不容懷疑，對人們認識某些疾病與基因變異的關系起了很大的作用。但是，由于同位素不穩(wěn)定和放射性危害，不能常規(guī)用于臨床或法醫(yī)檢驗，用非放射性物質（生物素、熒光素和地高辛等）標記的寡核苷酸探針分析PCR產物以確定核酸序列變異則是一種簡便而安全的方法。非放射性標記物質穩(wěn)定性高，使用方便、安全、檢測速度快。
3、微孔板夾心雜交法
該法是通過一固定于微孔板的捕獲探針與PCR產物的某一區(qū)域特異雜交使產物間接地固定于微孔板上。然后，再用一生物素等非放射性標記物標記的檢測探針與產物的另一區(qū)域雜交，漂洗后顯色即可判斷結果，該法需要兩個雜交過程來檢測一個產物，因此，其特異性較一次雜交的檢測法高。該法已用于HBV的檢測，其敏感度可達5個HBv DNA分子。此法的敏感性和特異性與PCR 32P探針的Southern雜交法相當。但PCR微孔板夾心雜交法操作簡便、快速、避免了同位素標記探針的危害，顯色反應類似于臨床常規(guī)應用的ELISA,適于臨床實驗室常規(guī)應用。
4、PCR-ELISA法
本法避免了電泳和雜交的步驟，適于常規(guī)ELISA記數(shù)儀檢測。因為5'端修飾后仍可進行常規(guī)PCR擴增特異靶序列。因此，可以通過修飾一個引物的5′端使其攜帶便于PCR產物固定的功能基因，而通過另一引物5′-端的修飾使產物便于檢測。
