利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)步驟

LipoGene2000、Lipofectamine 3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑是一種常用的陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，它可以 有效地將質(zhì)�；� siRNA 以及核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的貼壁和懸浮細(xì)胞系中。研究人員經(jīng)常使用 LipoGene/ Lipofectamine 系列轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行基于 siRNA 和 shRNA 的基因敲除實(shí)驗(yàn)以及基因表達(dá)研究。293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)步驟如下：



1、細(xì)胞培養(yǎng)：以293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染前一天（20-24小時(shí)）~0.4×10 ⁶ 個(gè)細(xì)胞（具體細(xì)胞數(shù)取決于細(xì)胞大小和細(xì)胞生長速度），接種到六孔板中，使其達(dá)到70-90%次日轉(zhuǎn)染時(shí)匯合。
2. 在接下來的轉(zhuǎn)染步驟之前更換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的體積約為 2 ml。
3. 輕輕混合 Lip脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑。
4. 取無菌離心管，在 250 μl DMEM 溶液中加入 4 μg 質(zhì)粒，用移液器輕輕混勻。
這里需要注意兩點(diǎn)：
a.抗生素、谷氨酰胺等對(duì) LipoGene 轉(zhuǎn)染或Lipofectamine沒有影響。如果 Lip轉(zhuǎn)染試劑表現(xiàn)出對(duì)靶細(xì)胞毒性作用 ，建議從轉(zhuǎn)染系統(tǒng)中去除抗生素。
b.如果有必要，DMEM 可以更換為其他培養(yǎng)基，如 1640、 MEM、F12 等，這對(duì) Lip轉(zhuǎn)染試劑 的轉(zhuǎn)染效率沒有影響。質(zhì)粒的量可在0.1μg ～4μg范圍內(nèi)適當(dāng)調(diào)整，Lip的量通常為4～ 8μl（質(zhì)粒體積/LipoGene體積=1:1～1:2 ）。由于細(xì)胞類型、培養(yǎng)條件、轉(zhuǎn)染參數(shù)等會(huì)極大地影響轉(zhuǎn)染效率，因此需要在推薦范圍內(nèi)優(yōu)化質(zhì)粒體積/Lip轉(zhuǎn)染試劑體積。對(duì)于其他培養(yǎng)板或培養(yǎng)容器，各試劑用量可參照轉(zhuǎn)染試劑相關(guān)說明表進(jìn)行換算。
5. 取另一個(gè)無菌離心管，在 250 μl DMEM 溶液中加入 6 μl LipoGene，用移液管輕輕混勻，室溫孵育 5 分鐘。
6. 用移液管將步驟 4 中的 DNA 溶液與步驟 5 中的 LipoGene 溶液輕輕混合。這個(gè)過程中需要注意不要渦旋或離心。
7. 在室溫下孵育 LipoGene-DNA 混合物 20 分鐘�？赡軙�(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，屬于正常現(xiàn)象，不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。
8. 將 500 μl LipoGene-DNA 混合物加入六孔板的一個(gè)孔中，無論是貼壁細(xì)胞還是懸浮細(xì)胞，然后輕輕搖晃并混合成“8”字形。
9. 注意：對(duì)于貼壁細(xì)胞，如上所述，只需將 LipoGene-DNA 復(fù)合物添加到細(xì)胞中并孵育 6 小時(shí)，然后再更換溶液。如果轉(zhuǎn)染懸浮或半懸浮細(xì)胞，建議使用平角離心法，在細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入適量的 LipoGene-DNA復(fù)合物后（步驟8），密封密封膜，放入平角離心機(jī)，低速 (200 g) 離心 1.5 小時(shí)，然后放入培養(yǎng)箱中 6 小時(shí)，然后更換培養(yǎng)基。
10. 培養(yǎng)6-12小時(shí)后，用完全培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。



這里需要注意的是：當(dāng)與細(xì)胞一起孵育 6 小時(shí)時(shí)，Lip試劑轉(zhuǎn)染后的混合物通常足以產(chǎn)生高轉(zhuǎn)染效率。大多數(shù)細(xì)胞與 LipGene型轉(zhuǎn)染試劑一起培養(yǎng)長達(dá) 72 小時(shí)，沒有明顯的細(xì)胞毒性。但是，轉(zhuǎn)染后6小時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基可以提高一些生長較快的細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。對(duì)于一些容易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如HEK-293T細(xì)胞，是否更換轉(zhuǎn)染液主要 取決于細(xì)胞的生長狀態(tài)，細(xì)胞生長快轉(zhuǎn)染效率就高。

11、細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的操作：
1）基因表達(dá)，24-40小時(shí)后可檢測轉(zhuǎn)染效率。可以用熒光顯微鏡觀察 GFP 或其他熒光基因的表達(dá)。
2）構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)可加入合適的篩選藥物如G418或嘌呤霉素篩選穩(wěn)定細(xì)胞株

293t細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)步驟 中的注意事項(xiàng)：
1. 使用高的純度 DNA (A260/A280=1.8) 有助于獲得較高的轉(zhuǎn)染效率。對(duì)于質(zhì)粒，建議使用 Qiagen 或天根的質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行高質(zhì)量且無內(nèi)毒素的提取。
2、細(xì)胞的生長狀態(tài)會(huì)對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率造成較大影響，所以轉(zhuǎn)染前細(xì)胞要處于良好的生長狀態(tài)。
3.轉(zhuǎn)染試劑盒中一般是不帶DMEM培養(yǎng)基，需要自行配備。其他培養(yǎng)基如 1640、MEM、α-MEM 、F12、DMEM/F12 和 M199 也是可以 可用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的。
4. LipoGene 或Lipofectamine脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑不能渦旋或離心。當(dāng)該試劑放置較長時(shí)間時(shí)，只需輕輕搖晃并混合即可。
5. 試劑長時(shí)間暴露在空氣中，也有可能會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率。
6、出于健康和安全的考慮，需要在符合潔凈度要求的細(xì)胞培養(yǎng)室進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并穿戴實(shí)驗(yàn)室外套和一次性手套、口罩和無菌帽。

蘇州阿爾法生物提供的細(xì)胞生物反應(yīng)器、微生物發(fā)酵罐等細(xì)胞規(guī)�；�生產(chǎn)設(shè)備還可根據(jù)客戶要求的尺寸進(jìn)行定制化操作，可用于 HEK293細(xì)胞 的培養(yǎng),懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、貼壁細(xì)胞培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、微生物培養(yǎng)的生物反應(yīng)器 并提供、生物反應(yīng)器安裝服務(wù)技術(shù)支持、操作指導(dǎo)以及脂質(zhì)體細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑、電轉(zhuǎn)儀等。