微生物培養(yǎng)法、生化法和PCR法常見三種支原體檢測方法比較
細胞培養(yǎng)在科研和生物制藥中被廣泛應(yīng)用，支原體污染問題頻繁出現(xiàn)，污染會影響細胞的生長、形態(tài)、生化特點和遺傳特征。因此，為了提高生物制品的有效性和安全性，各國監(jiān)管機構(gòu)和法規(guī)都建議使用適當(dāng)?shù)臋z測方法對細胞進行檢測，以確保使用的細胞無支原體污染。
迄今為止，已經(jīng)有多種支原體檢測方法，包括培養(yǎng)法、指示細胞法、基于核酸擴增（NAT）的方法和基于酶促反應(yīng)的方法（生化法），每種方法都有各自的特點和應(yīng)用范圍。培養(yǎng)法作為經(jīng)典方法，通過有無支原體生長進行判斷，最直接，但是檢測時間是一個最大的挑戰(zhàn)；指示細胞法檢測時間稍微有所縮短，但是靈敏度是一個問題。NAT方法檢測時間短，是直接對支原體的核酸進行擴增，但是覆蓋率和準(zhǔn)確度以及對死活支原體的區(qū)分有一定的挑戰(zhàn)；基于酶促反應(yīng)的生化法檢測的時間最短，對活的支原體進行檢測，靈敏度適中。
生化法是基于支原體的生化活性的檢測方法，相關(guān)試劑盒可檢測支原體酶，如乙酸激酶和氨基甲酸酯激酶。這些酶能夠在磷酸乙�；土姿岚被柞；孜锎嬖谙麓呋疉DP轉(zhuǎn)化為ATP，進而在熒光素酶作用下使得熒光素底物反應(yīng)釋放化學(xué)發(fā)光信號。靈敏度較高、準(zhǔn)確、特異和快速（20mins）是生化法檢測的主要優(yōu)點。推薦用于細胞、培養(yǎng)基、血清等樣品的快速污染檢測和篩查。
生化法檢測原理：
表1常見三種支原體檢測方法的比較
題為“Sensitivityof biochemical test in comparison with other methods for thedetection of mycoplasma contamination in human and animal cell linesstored in the National Cell Bank of Iran"論文采用培養(yǎng)法、生化法（LonzaMycoAlert®試劑盒）和PCR法對細胞庫大量的細胞進行污染檢測，并對這些方法的敏感性、特異性、準(zhǔn)確性和便捷性（速度）進行了比較，認為MycoAlert生化法由于其靈敏度、特異性和檢測速度的多方面優(yōu)勢，可被視為傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)和DNA染色熒光染料方法的替代方法。這與美國藥典（USP）的描述內(nèi)容一致，“Avalidated nucleic acid amplification technique(NAT) or an enzymaticactivity based method may be used to detect Mycoplasma"。
該研究中，研究人員隨機選取了40種不同的人和動物細胞系，分別以Vero和NSO細胞系為陽性和陰性對照，使用培養(yǎng)法、生化法和PCR方法進行支原體檢測。結(jié)果匯總?cè)缦拢?br />
表2三種方法檢測結(jié)果
檢測結(jié)果進行SPSS統(tǒng)計學(xué)分析并以培養(yǎng)法為參照，計算陽性和陰性結(jié)果的敏感性、特異性、準(zhǔn)確性和預(yù)測值，統(tǒng)計結(jié)果見圖1。
圖1.三種支原體檢測方法在特異性、敏感性和準(zhǔn)確性參數(shù)上的統(tǒng)計學(xué)比較
由此結(jié)果可以看出：生化法具有出色的靈敏度、準(zhǔn)確度、特異性，而且檢測時間短（＜20mins），可以成為培養(yǎng)法和染色法的較好替代。該方法只能檢測活的支原體，因此可以跟PCR法形成較好的檢測互補。
研究中所使用的生化法試劑盒MycoAlert來自于Lonza,作為業(yè)內(nèi)經(jīng)典的生化法支原體檢測試劑盒，其檢測靈敏度為＜50cfu/mL，對A.laidlawii、M.hyorhinis和M.orale的靈敏度為10~20cfu/mL。
圖2.MycoAlert®試劑盒檢測示意圖和靈敏度結(jié)果
目前Lonza已經(jīng)推出了升級版本的支原體試劑盒MycoAlert®Plus，除了可以在Lonza Lucetta™ 2檢測設(shè)備之外，由于其更佳的檢測靈敏度，還可以使用各種酶標(biāo)儀進行高通量支原體檢測。
