WB實(shí)驗(yàn)中樣品制備環(huán)節(jié)的哪些因素會(huì)帶來(lái)雜帶呢？

做有效的樣品制備不僅能讓咱們事半功倍，節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間；同時(shí)它還會(huì)影響 WB 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，以及實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。

那么究竟什么樣的蛋白樣品才是成功有效的呢？

有人說(shuō)：能測(cè)出陽(yáng)性條帶的樣品！（沒(méi)毛病，非常正確�。�

那測(cè)出來(lái)的條帶有雜帶呢？

那一定是抗體的鍋，反手就是一個(gè)投訴！（抗體表示有些委屈 ～）

其實(shí)，在 WB 檢測(cè)過(guò)程中出現(xiàn)非特異性條帶，除了一抗因素，樣品也可能是那個(gè)罪魁禍?zhǔn)祝?/p>

樣品制備環(huán)節(jié)的哪些因素會(huì)帶來(lái)雜帶呢？小 P 帶大家梳理一下 ～
 

1. 細(xì)胞污染

解析：

細(xì)胞樣品的交叉污染、分化和傳代次數(shù)過(guò)多，都會(huì)使蛋白的表達(dá)譜發(fā)生變化而出現(xiàn)雜帶。Vimentin 在 MCF-7 中本不表達(dá)，但由于以上原因?qū)е?Vimentin 抗體能在 MCF-7 細(xì)胞中檢測(cè)到條帶（雜帶）。

對(duì)策：

1）確保細(xì)胞來(lái)源，最好有 STR 鑒定；

2）規(guī)范細(xì)胞傳代的各個(gè)步驟，避免細(xì)胞的交叉污染；

3）嚴(yán)格控制傳代次數(shù)，20 代以內(nèi)的細(xì)胞制樣最佳。

2. 胰蛋白酶剪切

解析：

樣品制備時(shí)，我們一般會(huì)使用胰蛋白酶消化一下細(xì)胞，此時(shí)有一些目的蛋白會(huì)被剪切成短片段，而這些短片段通常會(huì)被識(shí)別，從而出現(xiàn)「雜帶」。

對(duì)策：

針對(duì)該類樣本，不要使用蛋白酶消化，可以改用刮刀收集或直接加裂解液到細(xì)胞皿或細(xì)胞瓶中直接裂解。

3. 血液及血液制品干擾

解析：

血液里的 IgG 被二抗識(shí)別而出現(xiàn)雜帶。IgG 的重鏈和輕鏈在電泳過(guò)程中分離，且剛好該 IgG 與一抗同源，均被二抗識(shí)別而出現(xiàn)雜帶；一般重鏈條帶在 55 kDa 左右，輕鏈在 25 kDa 左右。

對(duì)策：

細(xì)胞和組織樣品，尤其是對(duì)于血含量多的組織（如：心、肝、脾、腎等），在裂解前需要充分的清洗，以完全去除血液和血清殘留。

4. 還原不徹底

解析：

蛋白樣品由于加的還原劑量不足或沒(méi)加而導(dǎo)致蛋白還原不徹底，以二聚體或多聚體存在，形成分子量更大的雜帶。

對(duì)策：

1）樣品制備時(shí)添加足量的還原劑，推薦 1X Loading Buffer 至少加 5% BME 或 100 mM DTT；

2）-20℃ 或 -80℃ 分裝保存的樣品在存放半年后，補(bǔ)加還原劑并 100℃ 煮樣 5 分鐘后再使用。

5. 內(nèi)源蛋白酶剪切

解析：

樣品在制樣過(guò)程中，除去人為添加的胰蛋白酶，內(nèi)源的蛋白酶也會(huì)被釋放到裂解液中，靶標(biāo)蛋白會(huì)在一定的程度上被降解、碎片化，形成片段更小的雜帶。

對(duì)策：

1）提取過(guò)程全程保持低溫，降低蛋白酶活性；

2）裂解液中加入高質(zhì)量的蛋白酶抑制劑，如 Proteintech 蛋白酶抑制劑混合液；

3）對(duì)于組織樣品，盡量取新鮮的樣品制備，制備方法選用液氮研磨的方法，將樣品降解可能降到最低；

4）樣品制備好后及時(shí)使用，如需保存可分裝成數(shù)管保存在 -20℃ 或 -80℃ 冰箱，避免反復(fù)凍融。

6. 裂解不充分 

解析：

由于樣本制備過(guò)程中裂解液加入量過(guò)少，導(dǎo)致樣品裂解不充分，凝膠孔中有大顆粒殘留。

對(duì)策：

樣品裂解時(shí)需要加充足的裂解液，推薦裂解液與細(xì)胞體積比至少為 3:1，不同組織和細(xì)胞之間需要調(diào)整。裂解完成后樣品濃度保持在 3-6 ug/ul 比較理想。

7. 樣品粘度大

解析：

樣品沒(méi)有超聲或超聲不徹底導(dǎo)致核酸未被打斷成小片段，從而導(dǎo)致樣品粘度高，WB 結(jié)果出現(xiàn)拖尾等雜帶。

對(duì)策：

1）樣品制備過(guò)程中對(duì)樣品進(jìn)行超聲波處理（推薦 1 ml 的樣品使用 200 W 超聲 2 分鐘），徹底的將核酸打斷。

2）存放一段時(shí)間的樣品如果出現(xiàn)粘稠，在使用前用超聲波處理直至不再粘稠。

8. 上樣量過(guò)多

解析：

在 WB 實(shí)驗(yàn)中，樣品上樣量過(guò)多，由于部分蛋白與抗體的非特異性結(jié)合增加，也會(huì)導(dǎo)致雜帶的出現(xiàn)。

對(duì)策：

實(shí)驗(yàn)時(shí)可以做一個(gè)樣本濃度梯度上樣，根據(jù)靶標(biāo)抗體的表達(dá)情況選擇合適的上樣量。
 

「道理都懂，狀況頻出」。理想和現(xiàn)實(shí)之間總是有些差距，稍微有一點(diǎn)細(xì)節(jié)沒(méi)注意就有可能中招。所以小伙伴們?cè)谥茦訒r(shí)一定要多注意細(xì)節(jié)，避免上述問(wèn)題。
 

以下是 Proteintech 公司資深樣品制備實(shí)驗(yàn)員為大家總結(jié)的樣品制備關(guān)鍵細(xì)節(jié)清單，希望對(duì)你們有幫助：

1）樣本制備的所有步驟必須低溫下進(jìn)行（冷血?jiǎng)游飿悠烦�外），所有試劑都需提前預(yù)冷。

2）細(xì)胞來(lái)源可靠（有 STR 鑒定），傳代次數(shù)不要過(guò)多，20 代以內(nèi)的細(xì)胞制樣最佳。

3）收集細(xì)胞不建議使用胰蛋白酶消化，可以選擇在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿內(nèi)直接裂解或用細(xì)胞刮收集細(xì)胞后再裂解。

4）對(duì)于組織樣品，盡量取新鮮的樣品制備。尤其是消化系統(tǒng)相關(guān)的組織，制備推薦選用液氮研磨的方法，在不影響提取效果的前提下，可以考慮高濃度 SDS 等強(qiáng)烈的裂解液以縮短裂解時(shí)間。

5）使用預(yù)冷的 PBS 洗凈細(xì)胞及組織中的外源蛋白和脂類，尤其是細(xì)胞培養(yǎng)液中的牛血清和組織塊中的血液。對(duì)于血含量多的組織（如：心、肝、脾、腎等）可以使用 200 目的網(wǎng)篩將其磨成單個(gè)細(xì)胞后再清洗，清洗的 PBS 中需加入適量的蛋白酶抑制劑。

6）樣品制備過(guò)程中需加入蛋白酶抑制劑，針對(duì)蛋白含量高或容易降解的細(xì)胞或組織可以加倍使用。用于磷酸化靶標(biāo)抗體的檢測(cè)還需加入磷酸酶抑制劑。

7）加入足量的裂解液不僅可以得到更多的可溶性蛋白，而且可以降低蛋白質(zhì)的聚集和黏度。推薦裂解液與細(xì)胞體積比至少為 3:1，不同組織和細(xì)胞之間需要調(diào)整。裂解完成后樣品濃度保持在 3-6 ug/ul 比較理想。

8）超聲破碎這一步十分重要，尤其對(duì)于核蛋白的提取極有幫助。通過(guò)超聲波可以將核酸打斷成小片段，從而使其不能形成完整的蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域而最終與蛋白分開(kāi)。

9）還原劑需現(xiàn)用現(xiàn)加，量要加足, 推薦每 1X 的蛋白上樣緩沖液（1X loading buffer）中至少加 5% BME 或 100 mM DTT。存放半年以上的樣品需補(bǔ)加還原劑煮樣后再使用。

10）蛋白樣品提取完成后，建議用 BCA 法準(zhǔn)確測(cè)定濃度，并將樣品的蛋白濃度和鹽離子濃度調(diào)到一致，以確保上樣量清楚可控。

11）樣品最好現(xiàn)制現(xiàn)用，如需保存，可分裝成數(shù)管保存在 -20℃ 或 -80℃ 冰箱，避免反復(fù)凍融。保存半年以上的樣品，推薦在使用前補(bǔ)加還原劑沸水煮樣后再使用。

最后，針對(duì)蛋白樣本制備中可能會(huì)用到的蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，Proteintech 也可提供經(jīng)過(guò)咱們反復(fù)錘煉的優(yōu)秀產(chǎn)品，這里給大家做個(gè)推薦，有需要的可以嘗試哦 ～

1. 蛋白酶抑制劑混合液（貨號(hào)：PR20016）

2. 磷酸酶抑制劑混合液（貨號(hào)：PR20015）
 

好啦，以上就是今天要和大家分享的全部?jī)?nèi)容，希望對(duì)你們有幫助 ～