α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase, α-GC）試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

 
注   意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：                           
α-GC(EC 3.2.1.20)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化水解芳基或烴基與糖基之間的α-糖苷鍵生成葡萄糖，不僅與細(xì)胞壁的松弛或加固有關(guān)，而且與細(xì)胞識(shí)別和一些信號(hào)分子產(chǎn)生密切相關(guān)。

測(cè)定原理：
α-GC分解對(duì)-硝基苯-α-D吡喃葡萄糖苷生成對(duì)-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通過(guò)測(cè)定吸光值升高速率來(lái)計(jì)算α-GC活性。

自備用品：
可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：
提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：粉劑×2瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入10mL蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。
試劑二：液體25mL×1瓶，4℃保存。
試劑三：液體50mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

• 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至400nm，蒸餾水調(diào)零。
• 加樣表

試劑名稱(chēng)（μL）	測(cè)定管	對(duì)照管
試劑一	400
蒸餾水		400
試劑二	500	500
樣本	100	100

充分混勻，放入37℃準(zhǔn)確水浴30min后，立即放入95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失），流水冷卻后
 
充分混勻（以保證濃度不變），8000g，4℃，離心5min，取上清液

上清液	500	500
試劑三	1000	1000

充分混勻，室溫靜置2min后， 400nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)，計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。
 
α-GC活力計(jì)算：
標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y =0.00543x -0.0027；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL），y為吸光值。
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。
α-GC活力(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T
=61.39×(ΔA+0.0027) ÷Cpr
需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。
α-GC活力(nmol/min /g鮮重)＝[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=61.39×(ΔA+0.0027) ÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。
α-GC活力(nmol/min /10⁴ cell)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00543×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)÷T
=0.123×(ΔA +0.0027)
V反總：反應(yīng)體系總體積，1mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)；T：反應(yīng)時(shí)間，30min。