現(xiàn)行細胞計數(shù)方法存在的問題與解決辦法
1. 細胞計數(shù)的意義
計數(shù)細胞是了解細胞數(shù)量變化的基本方法，細胞數(shù)量變化是細胞生理功能表現(xiàn)的重要指標，準確的細胞數(shù)量變化提供準確的功能信息，錯誤的細胞數(shù)量變化提供錯誤的功能信息。所以細胞計數(shù)準確性決定細胞生理學研究的成功與失敗。
2. 細胞計數(shù)要解決的問題
細胞計數(shù)的目的是確定細胞樣本中的細胞數(shù)量，一般是指單位體積內的細胞數(shù)量，如1升血樣本中含有多少個紅細胞，多少個白細胞；細胞學實驗經常需要比較細胞處理前后的數(shù)量變化。計數(shù)細胞就是確定細胞樣本處理前后每單位樣本中含有多少個細胞，即單位體積內的細胞數(shù)。
3. 現(xiàn)行細胞計數(shù)儀器和計數(shù)方法存在的問題
現(xiàn)在計數(shù)細胞的儀器和方法不少，但計數(shù)準確度都不高，達不到細胞學研究要求的水平。原因出在細胞計數(shù)儀設計師對細胞計數(shù)的目的要求和細胞計數(shù)操作過程，認識不夠清楚，設計的儀器結構原理有問題。以細胞計數(shù)板為例，細胞計數(shù)板的結構不太合理。細胞計數(shù)板的結構是在一片玻璃板上蝕刻出一個細胞計數(shù)池，呈方形，邊長1mm,深度0.1mm，容積是0.1mm3=0.1微升=萬分之一毫升，底面用線分割成方格。計數(shù)板計數(shù)的細胞數(shù)準確度沒有問題，刻蝕的容積也沒有問題，問題出在使用方法。細胞計數(shù)的時候，計數(shù)池上面加了一個蓋玻片，細胞樣本是從計數(shù)板與蓋玻片之間的縫隙中加進去的。細胞液充滿計數(shù)池和計數(shù)池與蓋玻片之間的空隙，這個空隙中的細胞也進入計數(shù)池。因此計數(shù)的細胞體積應該是計數(shù)池的體積加上空隙體積�？障扼w積是多大，不知道，計算細胞密度的時候都不計算內，被忽略掉了，所以細胞計數(shù)板計數(shù)的細胞密度不準確�？p隙體積很小，但相對于只有0.1微升的計數(shù)池體積，影響是很大的，可能達到15%或更大，所以是不可以忽略掉的。計數(shù)池容積太小和加蓋玻片是細胞計數(shù)板的致命傷。
細胞計數(shù)板是最常用的細胞計數(shù)方法，優(yōu)點是簡單、方便，計數(shù)細胞真實，數(shù)量準確。缺點是計量體積不準確，計數(shù)結果不準確，另外計數(shù)的細胞無法回收使用和細胞數(shù)量少于10萬的樣本無法計數(shù)也是問題。
細胞自動計數(shù)分析儀(Cellometer )是最近推出來的細胞計數(shù)方法。Cellometer的問題比較大。Cellometer是基于圖像分析的細胞計數(shù)儀。計數(shù)原理類似與血球計數(shù)板，只是用儀器攝像代替人眼觀察細胞計數(shù)。加20ml樣本到計數(shù)儀計數(shù)板的樣品室內，使細胞平鋪為單層細胞，將計數(shù)板放入計數(shù)儀內，通過儀器攝像頭選擇一個視野，記錄視野內的細胞。該儀器的細胞計數(shù)方法沒有記錄樣品室內的全部細胞，只是選取樣品室內細胞分布的一個視野進行計數(shù)。儀器設定的視野面積近似于血球計數(shù)板一個白細胞計數(shù)單位的面積，沒有考慮樣品深度，而且顯微鏡視野面積受放大倍數(shù)影響，面積和深度都不確定，體積更是問題，體積不準確，計數(shù)出來的細胞濃度不會準確。因此Cellometer細胞計數(shù)方法可信度很低。
流式細胞計數(shù)儀，以B.Dtc20-automated-cell-counter 為例，是臨床醫(yī)學應用比較多的細胞計數(shù)方法。這是一種基于庫爾特原理的細胞計數(shù)儀。庫爾特原理認為，懸浮在電解液中的顆粒隨電解液通過小孔管時，取代相同體積電解液，導致小孔管內外兩電極間電阻發(fā)生瞬時變化，產生電位脈沖，脈沖信號的大小和次數(shù)與顆粒的大小和數(shù)目成正比。這類細胞計數(shù)儀是根據(jù)細胞通過小孔引起電位變化計算細胞個數(shù)。儀器根據(jù)細胞體積大小設定脈沖信號上下限，在上下限之間的顆粒信號作為細胞記錄，大于上限和小于下限的顆粒信號不作為細胞記錄，與顆粒的顏色、形狀、性質無關。這種計數(shù)方法不能區(qū)分細胞與非細胞顆粒，體積與細胞大小相同的非細胞顆粒也作為細胞記錄下來，非細胞顆粒造成假陽性細胞，大于和小于設定孔徑的細胞不作細胞計數(shù)造成假陰性。這類細胞計數(shù)儀的優(yōu)點是，自動化程度高，快速方便，樣本體積計量準確；主要問題是存在假陽性和假陰性問題，誤差比較大，計數(shù)的細胞密度準確度或真實性不高，而且檢測的細胞數(shù)量不能太少，細胞不能回收使用。該方法用于臨床檢驗（要求準確度不高）還可以，但不適合細胞學實驗。
4. 細胞計數(shù)問題的解決辦法
上面介紹的三種類型細胞計數(shù)方法，涵蓋了現(xiàn)代生物醫(yī)學領域細胞計數(shù)的基本技術和方法。細胞計數(shù)是要獲得一個準確的細胞密度。細胞密度是單位體積內的細胞數(shù)量。計數(shù)細胞樣本的體積準確，細胞數(shù)準確，密度才會準確。三種細胞計數(shù)方法，要么計數(shù)樣本體積不準確（血球計數(shù)板，自動細胞計數(shù)儀），要么細胞計數(shù)不準確（流式細胞儀），所以細胞計數(shù)結果都不夠準確。
計數(shù)細胞獲得一個準確的細胞密度，看起來很復雜，難度很大，實際上真正理解了細胞計數(shù)的目的和要求，問題不難解決。如果能夠準確取一定容量細胞樣本，放到一個容器里，準確記錄全部細胞，問題就解決了。怎樣準確記錄一個容器里的全部細胞？如果容器里有幾百個細胞，無規(guī)律分布在底面上，用顯微鏡觀察，全部準確計數(shù)出來不太可能，如果把容器底部分割成許多個方格，標出行列號，一個方格中只有幾個細胞（不超過10個），很容易準確記錄出來，既不會漏計，也不會重計，將各個方格里的細胞數(shù)匯總起來就是全部細胞數(shù)。具體辦法是改變計數(shù)板的結構，加大計數(shù)池容積，設計一個底面積4.0mm´4.0mm,高度10.0mm,總體積是160微升的方形計數(shù)杯，底面上刻蝕16´16條線，標上行列號，構成256個方格。杯口稍大一些6.0mm´6.0mm，單個計數(shù)杯不好放置，最好8個一組并列成條狀，再給條型杯配置一個蓋子和一個架子。條形細胞計數(shù)杯用塑料做成一次性的，能夠滅菌處理，方便回收細胞。這樣的細胞計數(shù)杯，計數(shù)準確，造價低廉，使用方便。
如果做成方形杯有困難，可用一個簡單辦法替代，直接在96孔細胞培養(yǎng)（檢測）板的底面上刻蝕16´16條線也可以。96孔細胞培養(yǎng)板有條形的。
計數(shù)的時候，只需取一定量細胞液，如10.0微升，加入計數(shù)池或計數(shù)孔中，加蓋（不會與液面接觸）。這樣的計數(shù)板不能用正置顯微鏡計數(shù)，需要用倒置顯微鏡。
5. 新型細胞計數(shù)板的特點和適用對象
新型細胞計數(shù)板是一個底面上標記有方格的細胞培養(yǎng)板或檢測板。操作簡便，只需將一定量細胞液放入計數(shù)孔內，直接在顯微鏡下計數(shù)，計數(shù)值除以體積乘上稀釋倍數(shù)就是細胞濃度。計數(shù)板造價低廉，無菌處理，一次性使用。計數(shù)的細胞可以回收，再用于實驗。
新型細胞計數(shù)板的優(yōu)勢是計數(shù)的細胞濃度準確度高，計數(shù)的細胞可以回收使用。其他細胞計數(shù)儀器能解決的問題，它也能解決，但是它能解決的有些問題其他細胞計數(shù)儀器解決不了，如準確計數(shù)幾百個細胞，回收再用于實驗，上述三種細胞計數(shù)儀器都做不到。新型計數(shù)板適合細胞學和細胞免疫學實驗研究使用，是的主要應用對象，臨床檢驗細胞計數(shù)也可以應用。臨床檢驗要求細胞計數(shù)簡單快捷，能夠處理大批量樣本，不要求細胞計數(shù)非常準確，新型計數(shù)板可以做血細胞常規(guī)項目檢驗，但與流式細胞儀比較不具有優(yōu)勢。
新型細胞計數(shù)板輔助設備只需要一臺顯微鏡，使用簡單方便。既可以用于細胞學和細胞免疫學研究，也可以用于臨床檢驗。研究單位，臨床單位，教學單位，都可以應用，個體診所也買得起用得上。細胞準確計數(shù)的問題國內外都沒有解決，國內有需求，國外也有需求，所以應用市場非常廣闊。新型細胞計數(shù)板結構簡單，很容易設計制造，誰先制造出來，誰就占有了市場，后來者很難再有機會。
計數(shù)細胞是了解細胞數(shù)量變化的基本方法，細胞數(shù)量變化是細胞生理功能表現(xiàn)的重要指標，準確的細胞數(shù)量變化提供準確的功能信息，錯誤的細胞數(shù)量變化提供錯誤的功能信息。所以細胞計數(shù)準確性決定細胞生理學研究的成功與失敗。
2. 細胞計數(shù)要解決的問題
細胞計數(shù)的目的是確定細胞樣本中的細胞數(shù)量，一般是指單位體積內的細胞數(shù)量，如1升血樣本中含有多少個紅細胞，多少個白細胞；細胞學實驗經常需要比較細胞處理前后的數(shù)量變化。計數(shù)細胞就是確定細胞樣本處理前后每單位樣本中含有多少個細胞，即單位體積內的細胞數(shù)。
3. 現(xiàn)行細胞計數(shù)儀器和計數(shù)方法存在的問題
現(xiàn)在計數(shù)細胞的儀器和方法不少，但計數(shù)準確度都不高，達不到細胞學研究要求的水平。原因出在細胞計數(shù)儀設計師對細胞計數(shù)的目的要求和細胞計數(shù)操作過程，認識不夠清楚，設計的儀器結構原理有問題。以細胞計數(shù)板為例，細胞計數(shù)板的結構不太合理。細胞計數(shù)板的結構是在一片玻璃板上蝕刻出一個細胞計數(shù)池，呈方形，邊長1mm,深度0.1mm，容積是0.1mm3=0.1微升=萬分之一毫升，底面用線分割成方格。計數(shù)板計數(shù)的細胞數(shù)準確度沒有問題，刻蝕的容積也沒有問題，問題出在使用方法。細胞計數(shù)的時候，計數(shù)池上面加了一個蓋玻片，細胞樣本是從計數(shù)板與蓋玻片之間的縫隙中加進去的。細胞液充滿計數(shù)池和計數(shù)池與蓋玻片之間的空隙，這個空隙中的細胞也進入計數(shù)池。因此計數(shù)的細胞體積應該是計數(shù)池的體積加上空隙體積�？障扼w積是多大，不知道，計算細胞密度的時候都不計算內，被忽略掉了，所以細胞計數(shù)板計數(shù)的細胞密度不準確�？p隙體積很小，但相對于只有0.1微升的計數(shù)池體積，影響是很大的，可能達到15%或更大，所以是不可以忽略掉的。計數(shù)池容積太小和加蓋玻片是細胞計數(shù)板的致命傷。
細胞計數(shù)板是最常用的細胞計數(shù)方法，優(yōu)點是簡單、方便，計數(shù)細胞真實，數(shù)量準確。缺點是計量體積不準確，計數(shù)結果不準確，另外計數(shù)的細胞無法回收使用和細胞數(shù)量少于10萬的樣本無法計數(shù)也是問題。
細胞自動計數(shù)分析儀(Cellometer )是最近推出來的細胞計數(shù)方法。Cellometer的問題比較大。Cellometer是基于圖像分析的細胞計數(shù)儀。計數(shù)原理類似與血球計數(shù)板，只是用儀器攝像代替人眼觀察細胞計數(shù)。加20ml樣本到計數(shù)儀計數(shù)板的樣品室內，使細胞平鋪為單層細胞，將計數(shù)板放入計數(shù)儀內，通過儀器攝像頭選擇一個視野，記錄視野內的細胞。該儀器的細胞計數(shù)方法沒有記錄樣品室內的全部細胞，只是選取樣品室內細胞分布的一個視野進行計數(shù)。儀器設定的視野面積近似于血球計數(shù)板一個白細胞計數(shù)單位的面積，沒有考慮樣品深度，而且顯微鏡視野面積受放大倍數(shù)影響，面積和深度都不確定，體積更是問題，體積不準確，計數(shù)出來的細胞濃度不會準確。因此Cellometer細胞計數(shù)方法可信度很低。
流式細胞計數(shù)儀，以B.Dtc20-automated-cell-counter 為例，是臨床醫(yī)學應用比較多的細胞計數(shù)方法。這是一種基于庫爾特原理的細胞計數(shù)儀。庫爾特原理認為，懸浮在電解液中的顆粒隨電解液通過小孔管時，取代相同體積電解液，導致小孔管內外兩電極間電阻發(fā)生瞬時變化，產生電位脈沖，脈沖信號的大小和次數(shù)與顆粒的大小和數(shù)目成正比。這類細胞計數(shù)儀是根據(jù)細胞通過小孔引起電位變化計算細胞個數(shù)。儀器根據(jù)細胞體積大小設定脈沖信號上下限，在上下限之間的顆粒信號作為細胞記錄，大于上限和小于下限的顆粒信號不作為細胞記錄，與顆粒的顏色、形狀、性質無關。這種計數(shù)方法不能區(qū)分細胞與非細胞顆粒，體積與細胞大小相同的非細胞顆粒也作為細胞記錄下來，非細胞顆粒造成假陽性細胞，大于和小于設定孔徑的細胞不作細胞計數(shù)造成假陰性。這類細胞計數(shù)儀的優(yōu)點是，自動化程度高，快速方便，樣本體積計量準確；主要問題是存在假陽性和假陰性問題，誤差比較大，計數(shù)的細胞密度準確度或真實性不高，而且檢測的細胞數(shù)量不能太少，細胞不能回收使用。該方法用于臨床檢驗（要求準確度不高）還可以，但不適合細胞學實驗。
4. 細胞計數(shù)問題的解決辦法
上面介紹的三種類型細胞計數(shù)方法，涵蓋了現(xiàn)代生物醫(yī)學領域細胞計數(shù)的基本技術和方法。細胞計數(shù)是要獲得一個準確的細胞密度。細胞密度是單位體積內的細胞數(shù)量。計數(shù)細胞樣本的體積準確，細胞數(shù)準確，密度才會準確。三種細胞計數(shù)方法，要么計數(shù)樣本體積不準確（血球計數(shù)板，自動細胞計數(shù)儀），要么細胞計數(shù)不準確（流式細胞儀），所以細胞計數(shù)結果都不夠準確。
計數(shù)細胞獲得一個準確的細胞密度，看起來很復雜，難度很大，實際上真正理解了細胞計數(shù)的目的和要求，問題不難解決。如果能夠準確取一定容量細胞樣本，放到一個容器里，準確記錄全部細胞，問題就解決了。怎樣準確記錄一個容器里的全部細胞？如果容器里有幾百個細胞，無規(guī)律分布在底面上，用顯微鏡觀察，全部準確計數(shù)出來不太可能，如果把容器底部分割成許多個方格，標出行列號，一個方格中只有幾個細胞（不超過10個），很容易準確記錄出來，既不會漏計，也不會重計，將各個方格里的細胞數(shù)匯總起來就是全部細胞數(shù)。具體辦法是改變計數(shù)板的結構，加大計數(shù)池容積，設計一個底面積4.0mm´4.0mm,高度10.0mm,總體積是160微升的方形計數(shù)杯，底面上刻蝕16´16條線，標上行列號，構成256個方格。杯口稍大一些6.0mm´6.0mm，單個計數(shù)杯不好放置，最好8個一組并列成條狀，再給條型杯配置一個蓋子和一個架子。條形細胞計數(shù)杯用塑料做成一次性的，能夠滅菌處理，方便回收細胞。這樣的細胞計數(shù)杯，計數(shù)準確，造價低廉，使用方便。
如果做成方形杯有困難，可用一個簡單辦法替代，直接在96孔細胞培養(yǎng)（檢測）板的底面上刻蝕16´16條線也可以。96孔細胞培養(yǎng)板有條形的。
計數(shù)的時候，只需取一定量細胞液，如10.0微升，加入計數(shù)池或計數(shù)孔中，加蓋（不會與液面接觸）。這樣的計數(shù)板不能用正置顯微鏡計數(shù)，需要用倒置顯微鏡。
5. 新型細胞計數(shù)板的特點和適用對象
新型細胞計數(shù)板是一個底面上標記有方格的細胞培養(yǎng)板或檢測板。操作簡便，只需將一定量細胞液放入計數(shù)孔內，直接在顯微鏡下計數(shù)，計數(shù)值除以體積乘上稀釋倍數(shù)就是細胞濃度。計數(shù)板造價低廉，無菌處理，一次性使用。計數(shù)的細胞可以回收，再用于實驗。
新型細胞計數(shù)板的優(yōu)勢是計數(shù)的細胞濃度準確度高，計數(shù)的細胞可以回收使用。其他細胞計數(shù)儀器能解決的問題，它也能解決，但是它能解決的有些問題其他細胞計數(shù)儀器解決不了，如準確計數(shù)幾百個細胞，回收再用于實驗，上述三種細胞計數(shù)儀器都做不到。新型計數(shù)板適合細胞學和細胞免疫學實驗研究使用，是的主要應用對象，臨床檢驗細胞計數(shù)也可以應用。臨床檢驗要求細胞計數(shù)簡單快捷，能夠處理大批量樣本，不要求細胞計數(shù)非常準確，新型計數(shù)板可以做血細胞常規(guī)項目檢驗，但與流式細胞儀比較不具有優(yōu)勢。
新型細胞計數(shù)板輔助設備只需要一臺顯微鏡，使用簡單方便。既可以用于細胞學和細胞免疫學研究，也可以用于臨床檢驗。研究單位，臨床單位，教學單位，都可以應用，個體診所也買得起用得上。細胞準確計數(shù)的問題國內外都沒有解決，國內有需求，國外也有需求，所以應用市場非常廣闊。新型細胞計數(shù)板結構簡單，很容易設計制造，誰先制造出來，誰就占有了市場，后來者很難再有機會。
歡迎掃描下方微信二維碼參與討論
