細(xì)胞“磷酸鈣轉(zhuǎn)染法”實(shí)驗(yàn)過(guò)程你們知道嗎?

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法主要包括：電穿孔法、磷酸鈣沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染等，理想的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法是具有高轉(zhuǎn)染效率、對(duì)細(xì)胞的毒性作用小等.
磷酸鈣轉(zhuǎn)染法實(shí)驗(yàn)過(guò)程:

1. 轉(zhuǎn)染前24小時(shí)選擇狀態(tài)良好的293T細(xì)胞傳代， 4×10^6個(gè)細(xì)胞接種于10cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中。

2. 20-24h后，待細(xì)胞長(zhǎng)至鋪滿細(xì)胞皿底約40-50%的時(shí)候，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

A：取1.5mlEP管，加入質(zhì)粒：

Lentivirus vector： 10ug

VSVG 質(zhì)粒 5ug

REV 質(zhì)粒 5ug

選擇超純水補(bǔ)至100ul。

向上述DNA溶液中加入50ul 2 M CaCl2 溶液，輕輕吹吸混勻。

B．向上述液體中逐滴加入2XHBS，立即吹打混勻在至呈現(xiàn)乳白色�；蛘哌x用電動(dòng)移液槍，一邊滴加，一邊用電動(dòng)移液槍進(jìn)行吹打。不要超過(guò)一分鐘。

C．將制備的混懸液室溫放置10-15分鐘。

D．將制備的混懸液輕輕地均勻滴入培養(yǎng)皿，輕輕搖勻后置于培養(yǎng)箱中，6-8h后換液。

因?yàn)樵诖荡蚧靹蛞后w過(guò)程中，每個(gè)人的吹打力度不同，因此在制備混合液后可以取載玻片置于顯微鏡下，滴加一滴混合液，觀察些顆粒大小。以便摸索實(shí)驗(yàn)的合適條件。

3、轉(zhuǎn)染12至16小時(shí)之后給293T細(xì)胞換液。

4、轉(zhuǎn)染48小時(shí)之后，如果質(zhì)粒帶有熒光標(biāo)簽，可以通過(guò)觀察熒光判斷轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)收集293T細(xì)胞的培養(yǎng)基, 3000rpm離心10分鐘去除細(xì)胞碎片。

5、將離心后上清進(jìn)行分裝，如果一周內(nèi)使用，可以臨時(shí)放于4度冰箱。將其他分裝的上清凍存于－80度冰箱中。因?yàn)椴《旧锨宸磸?fù)凍融，會(huì)造成病毒的滴度明顯下降。