從臍靜脈分離干細胞操作步驟

從臍靜脈分離干細胞

試劑和材料：
1.培養(yǎng)基：完全LG-DMEM：含2mmol/L的左旋谷氨酰胺的低糖DMEM，添加10%熱滅活胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素；
2.A；
3.胰蛋白酶，0.05%，含EDTA；
4.膠原酶A，0.1%用A配制；
5.培養(yǎng)瓶；
6.導管；

實驗方法：
1.在正常分娩后6-12h內(nèi)收集和處理臍帶；
2.在臍靜脈內(nèi)插入導管，用A完全地洗2次；
3.夾住遠端臍帶；
4.用0.1%膠原酶溶液充滿靜脈；
5.夾住近端臍帶；
6.將臍帶在37℃孵育20min；
7.輕輕按摩臍帶，收集含有內(nèi)皮和內(nèi)皮下層細胞的懸浮液，600g離心10min；
8.用培養(yǎng)基重懸細胞；
9.計數(shù)后，按1&time10³個細胞/cm2的密度將細胞接種到75cm²的培養(yǎng)瓶中；
10.3天后更換培養(yǎng)基，除去未貼壁細胞，保留貼壁的細胞繼續(xù)生長，每3天更換一次新鮮培養(yǎng)基，至大約2周后可見成纖維樣細胞生長；
11.在這種情況下，用0.25%胰蛋白酶/EDTA收集細胞，傳代到新培養(yǎng)瓶中繼續(xù)擴增；