甲基化特異性PCR(MSP)檢測(cè)基因啟動(dòng)子甲基化技術(shù)服務(wù)

甲基化特異性PCR(MSP)檢測(cè)基因啟動(dòng)子甲基化

甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA Methyltransferase, DNMT）催化作用下,利用S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶環(huán)的五號(hào)碳原子上加上甲基的共價(jià)修飾過(guò)程.

DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要方式，它不改變DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)，卻在細(xì)胞的發(fā)育、基因的表達(dá)、及基因組的穩(wěn)定性中起著重要的作用。

CpG島的高甲基化是腫瘤中存在的普遍現(xiàn)象，而啟動(dòng)子CpG島的高甲基化是除突變和缺失外腫瘤中抑癌基因失活的第三種機(jī)制。

因此，基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)在臨床診斷（如甲基化檢測(cè)與低劑量CT相結(jié)合）、藥物敏感性檢測(cè)等方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

目前甲基化特異性PCR(Methylmion Specific PCR，MSP)及其改進(jìn)方法是檢測(cè)基因甲基化的經(jīng)典方法．MSP法的原理是首先用亞硫酸氫鈉修飾處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶都被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶則不變。然后設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化和非甲基化序列的引物并進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，最后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析，確定與引物互補(bǔ)的DNA序列的甲基化狀態(tài)。MSP法靈敏度較高，應(yīng)用范圍廣。

MSP實(shí)驗(yàn)流程：

  抽提基因組DNA，并定量

 （組織、細(xì)胞、全血、血漿/清等）

亞硫酸氫鈉處理DNA

（pH5.0 50℃ 8-16hr所有試劑新鮮配制）

DNA修飾后純化回收

PCR/Real-time PCR檢測(cè)（引物、退火溫度）

瓊脂糖凝膠電泳/拷貝數(shù)                                

難點(diǎn)：

1、 實(shí)驗(yàn)流程長(zhǎng)，操作煩瑣，不易控制；

2、 起始DNA量不能太多，否則修飾不完全；但量太少，在漫長(zhǎng)的修飾、回收過(guò)程中容易丟失，所以要求熟練而精細(xì)的實(shí)驗(yàn)操作。

3、 修飾過(guò)程中的pH值要絕對(duì)準(zhǔn)確、所有試劑要求新鮮配置，并且需要反復(fù)摸索找出合適的反映時(shí)間。

4、 PCR引物設(shè)計(jì)、退火溫度選擇、Taq酶及Buffer的選擇都需要不斷優(yōu)化。

總之，在MSP過(guò)程中，影響結(jié)果的因素比較多，想要得比較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不僅要求高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)試劑，更要求豐富的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)和良好的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣。

迪奧生物憑借多年分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)和穩(wěn)定的技術(shù)平臺(tái)，還有數(shù)百例MSP的成功經(jīng)驗(yàn)，已經(jīng)建立了Taqman探針法檢測(cè)基因啟動(dòng)子甲基化的技術(shù)體系，并且在臨床應(yīng)用方面與多家醫(yī)院建立了穩(wěn)定的合作關(guān)系！

使用儀器：美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（ABI）Veriti^TM梯度PCR儀