安捷倫科技全新 NGS 文庫(kù)制備質(zhì)控白皮書(shū)開(kāi)放下載

二代測(cè)序 (NGS) 是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的必要工具，可在多種基礎(chǔ)、轉(zhuǎn)化和臨床研究環(huán)境中用于分析核酸樣品。樣品文庫(kù)制備是 NGS 工作流程中的關(guān)鍵步驟，不僅耗時(shí)費(fèi)力且成本較高。對(duì)制備過(guò)程中間步驟的起始樣品，以及對(duì)測(cè)序之前的最終文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)量控制 (QC)，可識(shí)別質(zhì)量較差或濃度不足的樣品，確保獲得成功的序列數(shù)據(jù)，有助于節(jié)省時(shí)間和資源。樣品質(zhì)量信息還可幫助排除故障或優(yōu)化文庫(kù)制備方案。
一般而言，制備 NGS 文庫(kù)所需的步驟包括起始樣品的片段化、平臺(tái)特異性測(cè)序接頭與樣品的連接以及擴(kuò)增文庫(kù)以產(chǎn)生足夠的測(cè)序材料。由于最終測(cè)序結(jié)果的質(zhì)量高度依賴于文庫(kù)的質(zhì)量，因此在整個(gè)文庫(kù)制備工作流程的各個(gè)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行 QC 檢查有很大幫助。建議在開(kāi)始文庫(kù)制備方案之前以及片段化、接頭連接、序列捕獲后或得到最終文庫(kù)之后進(jìn)行 QC 檢查。QC 檢查可提供有關(guān)樣品大小、濃度和完整性的有價(jià)值的信息，高質(zhì)量樣品對(duì)于成功測(cè)序必不可少。
   通過(guò)本書(shū)，您將了解到：

• NGS 文庫(kù)制備中起始材料的質(zhì)量控制
• 整個(gè) NGS 文庫(kù)制備過(guò)程的質(zhì)量控制
• 最終 NGS 文庫(kù)的質(zhì)量控制
• ……

  
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NGS 文庫(kù)制備中起始材料的質(zhì)量控制
文庫(kù)制備過(guò)程中最重要的 QC 步驟之一發(fā)生在 NGS 工作流程開(kāi)始之前。這一關(guān)鍵 QC 步驟就是分析要使用的起始材料，無(wú)論是 DNA 還是 RNA。確保高質(zhì)量的起始材料是制備高質(zhì)量文庫(kù)并獲得成功測(cè)序結(jié)果的第一步。大多數(shù) NGS 文庫(kù)制備試劑盒建議使用特定的起始濃度和起始量，以獲得最佳測(cè)序結(jié)果。如果起始材料降解或質(zhì)量較差，可能會(huì)難以甚至無(wú)法利用樣品創(chuàng)建文庫(kù)。一些研究考察了樣品質(zhì)量和下游分析之間的相關(guān)性。
 
整個(gè) NGS 文庫(kù)制備過(guò)程的質(zhì)量控制
確定了用于 NGS 文庫(kù)制備的合適樣品后，需采取多個(gè)步驟將其轉(zhuǎn)變?yōu)橛糜跍y(cè)序的合適文庫(kù)。為了獲得良好可靠的測(cè)序數(shù)據(jù)，強(qiáng)烈建議在工作流程中多個(gè)環(huán)節(jié)設(shè)置 QC 檢查點(diǎn)，以確保創(chuàng)建高質(zhì)量文庫(kù)。檢查點(diǎn)中包括片段化和接頭連接后的樣品 QC。
  圖 2. 使用安捷倫 TapeStation 系統(tǒng)對(duì)接頭連接進(jìn)行 QC。(A) 插入片段（紅色）和雙鏈接頭（藍(lán)色）的示意圖；(B) 由單鏈 DNA 組成的雙鏈接頭的電泳圖，在 75 bp 處顯示有一個(gè)峰；(C) 165 bp 為起始 DNA；(D) 使用 B 和 C 作為參照，連接后 QC 中顯示的四個(gè)峰經(jīng)鑒定為未連接接頭、未連接的插入片段，單端連接產(chǎn)物和雙端連接產(chǎn)物。PCR 后帶有雙端接頭的 165 bp 插入片段的樣品譜圖 (E) 和 (F) 示意圖。
 
最終 NGS 文庫(kù)的質(zhì)量控制
文庫(kù)制備的最后一步是 PCR 擴(kuò)增，可捕獲連接接頭的片段，并生成足夠的文庫(kù)拷貝用于測(cè)序。此步驟還可以用于添加標(biāo)簽，以在單次測(cè)序運(yùn)行中對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行多重檢測(cè)。盡管最終文庫(kù)的分子量和形狀取決于所使用的文庫(kù)制備試劑盒，但使用任何一種自動(dòng)化電泳平臺(tái)均可對(duì)所有類型的文庫(kù)進(jìn)行可視化和分析。除文庫(kù)彌散峰以外的任何其他峰均表明存在過(guò)量的引物或接頭二聚體。此階段的分析還有助于確定文庫(kù)擴(kuò)增是否過(guò)度或不足，并利于混合文庫(kù)以進(jìn)行測(cè)序。最終文庫(kù)的 QC 可確保高質(zhì)量的制備，并可確定文庫(kù)的分子量、濃度和摩爾濃度。
 
安捷倫自動(dòng)化電泳產(chǎn)品系列提供了多種用于核酸 QC 分析的儀器，包括生物分析儀系統(tǒng)、片段分析儀系統(tǒng)、TapeStation 系統(tǒng)和 Femto Pulse 系統(tǒng)。自動(dòng)化電泳儀非常適合在整個(gè) NGS 文庫(kù)制備過(guò)程中測(cè)定樣品的分子量大小、濃度和摩爾濃度，已在科學(xué)文獻(xiàn)中廣為引用。