層析填料壽命研究的法規(guī)要求、影響因素及研究策略

層析工藝已日漸成為生物制品生產(chǎn)工藝中不可或缺的工藝步驟。通常，一個(gè)生產(chǎn)工藝需要設(shè)計(jì)多個(gè)正交的層析步驟來(lái)達(dá)到較高的目標(biāo)純度水平，最大限度地減少殘留雜質(zhì)水平，并滿足與外源性物質(zhì)有關(guān)的安全標(biāo)準(zhǔn)。

工藝的操作成本很大程度上是由層析填料的成本驅(qū)動(dòng)的，因此層析填料可使用的批次或循環(huán)次數(shù)（層析填料壽命）對(duì)生產(chǎn)成本的控制至關(guān)重要。

各國(guó)監(jiān)管部門出于對(duì)藥品安全性和有效性的考量，其法規(guī)文件明確規(guī)定了對(duì)“層析填料的使用壽命及可接受限度”的要求。

Table 1. 層析填料壽命研究的法規(guī)指南要求

此外，2021年，PDA發(fā)布了技術(shù)報(bào)告60-3《工藝驗(yàn)證：生命周期方法 附件2：生物制藥原料藥生產(chǎn)》，報(bào)告中明確提出提高層析介質(zhì)的相關(guān)驗(yàn)證是工藝驗(yàn)證的重要部分。

層析填料在使用過(guò)程中，會(huì)有很多影響其壽命的因素，主要包括以下幾點(diǎn)：
（1） 該步驟在純化工藝中的位置和來(lái)料的性質(zhì)。（一般而言，捕獲粗純階段填料壽命衰減得更快，精純階段填料壽命衰減得慢）
（2） 層析填料的再生、清潔和保存程序。
（3） 層析柱裝填和損耗。

層析填料壽命研究策略必須能夠完全反映商業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模的性能，或者必須能體現(xiàn)與商業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模之間的相關(guān)性。

Table 2. 層析填料壽命研究策略

注：監(jiān)控頻率（N）可根據(jù)對(duì)工藝的理解和實(shí)際情況做適應(yīng)性調(diào)整。

壽命驗(yàn)證前瞻性研究需要使用縮小模型來(lái)進(jìn)行。該縮小模型采用線性縮小的原則，即維持柱床高度、線性流速、上樣載量（可采用最差條件）、緩沖液用量（CV）和洗脫收集標(biāo)準(zhǔn)不變，縮小層析柱的柱直徑、體積流速和樣品體積，同時(shí)關(guān)注層析柱壓力、樣品擴(kuò)散、系統(tǒng)死體積和柱效等因素。

一般可使用工藝表征期間建立和確認(rèn)的縮小模型，因?yàn)橐呀?jīng)確認(rèn)了它可以代表商業(yè)化規(guī)模的工藝。

層析填料壽命研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需要考慮空白運(yùn)行（Carryover）。周期性地進(jìn)行空白運(yùn)行可以用于評(píng)估清潔程序效果和產(chǎn)品殘留程度。在空白運(yùn)行中，層析柱按照常規(guī)的步驟操作，不同之處在于，用水或者緩沖液代替來(lái)料上樣。

層析介質(zhì)的使用壽命根據(jù)檢測(cè)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)定義。檢測(cè)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)可以設(shè)定為一個(gè)具體的截止標(biāo)準(zhǔn)，比如收率＞80%，SEC-HPLC 純度＞95%等，也可以通過(guò)檢測(cè)循環(huán)次數(shù)間的一致性來(lái)定義，此時(shí)就不再設(shè)置具體數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)。

Table 3. 壽命研究的評(píng)價(jià)指標(biāo)及其可接受標(biāo)準(zhǔn)（舉例）

層析填料壽命研究的終點(diǎn)判定可以選擇達(dá)到檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的循環(huán)次數(shù)數(shù)值，或者出現(xiàn)批間異常的循環(huán)次數(shù)數(shù)值。通常較為保守的做法是將確定的循環(huán)次數(shù)數(shù)值乘以一個(gè)安全系數(shù)，來(lái)定義最終的層析填料壽命次數(shù)。

Novo-A Diamond親和填料是博格隆自主研發(fā)的新一代高耐堿Protein A抗體親和填料，可耐受0.5M~1.0M NaOH進(jìn)行CIP，填料的載量更高、壓力流速性能更好。

本案例使用含有單克隆抗體的細(xì)胞培養(yǎng)上清，對(duì)Novo-A Diamond親和填料進(jìn)行了188個(gè)循環(huán)的測(cè)試，用0.1M NaOH和0.5M NaOH進(jìn)行CIP，同時(shí)檢測(cè)洗脫收率、HCP、HCD、Protein A、SEC指標(biāo)。

測(cè)試數(shù)據(jù)表明Novo-A Diamond具有較高的載量（初始10%DBC為67 mg/mL），運(yùn)行156個(gè)循壞后依然高于初始10%DBC的80%；所有循環(huán)的收率穩(wěn)定，洗脫樣品純度穩(wěn)定，HCP、HCD和蛋白A的殘留始終處于較低的水平。

Fig.1 Novo-A Diamond 壽命研究各項(xiàng)數(shù)據(jù)檢測(cè)結(jié)果圖譜

層析填料作為生物制藥下游純化工藝中至關(guān)重要的原材料，其性能與生物藥物的產(chǎn)品質(zhì)量密切相關(guān)。通過(guò)填料壽命研究實(shí)驗(yàn)，不僅僅提高了生產(chǎn)工藝的可控性與經(jīng)濟(jì)性，也為商業(yè)化生產(chǎn)提供可靠保證。

參考資料
[1] 2020 版《中國(guó)藥典》三部“人用重組單克隆抗體制品總論”.
[2] FDA “Guidance for Industry：Process Validation: General Principles and Practices”.
[3] FDA “Points to Consider in the Manufacture and Testing ofMonoclonal Antibody Products for Human Use”.
[4] EMA “Guideline on process validation for the manufacture of biotechnology-derived active substances and data to be provided in the regulatory submission”.
[5] EMA “CPMP Position Statement on DNA and Host Cell Proteins (HCP) Impurities, Routine Testing Versus Validation Studies,” CPMP/BWP/382/97.
[6] PDA Technical Report No.60-3: Process validation: A lifecycle approach Annex 2: biopharmaceutical drug substances manufacturing. Parenteral Drug Association: 2021.