層析技術(shù)的四大經(jīng)典方式及其分離原理、優(yōu)勢、適用場景和選擇要點
在生物制藥研發(fā)與生產(chǎn)中，層析技術(shù)作為實現(xiàn)高純度分離的重要手段，被廣泛應(yīng)用于疫苗、抗體、重組蛋白等各類生物大分子的純化流程。層析的核心，是“填料”——這個看似不起眼的小球體，正是構(gòu)筑高效純化工藝的關(guān)鍵所在。
本期推文將帶你走近層析技術(shù)的四大經(jīng)典方式，了解其分離原理、優(yōu)勢、適用場景以及選擇要點，為你的工藝開發(fā)和技術(shù)理解打下基礎(chǔ)。
凝膠過濾是一種根據(jù)生物分子的大小及形狀來分離物質(zhì)的層析方法。凝膠過濾介質(zhì)為多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，生物分子越小，在介質(zhì)中走過的路徑越長，出峰越靠后。選擇凝膠過濾介質(zhì)關(guān)鍵在于選擇合適的分離范圍，其次要考慮介質(zhì)的機械性能和可放大性。
凝膠過濾層析術(shù)語
Fig.1 凝膠層析術(shù)語
大分子首先離開柱子，緊接著是中分子，最后是小分子。全部分離過程需要一個全柱體積的緩沖液通過凝膠過濾柱料。
Fig.2 凝膠層析過程層析圖譜
緩沖液：Tris-HCl（pH7~8）、磷酸鹽緩沖液（pH6~7.5），低濃度NaCl（如150mM減少吸附）。
不同材質(zhì)基架特點
• Bestdex：交聯(lián)的葡聚糖，常用于分子量差異極大的組群物質(zhì)快速分離，如脫鹽、緩沖液置換。
• Bestarose：交聯(lián)的瓊脂糖，中等壓力下的高流速可提供良好的分辨率和速度，適用于工業(yè)規(guī)模的大分子純化。
• Chromdex：高度交聯(lián)的瓊脂糖和葡聚糖，分辨率高、硬度大，是精細純化階段的良好選擇。
填料選擇要點
每種介質(zhì)的孔徑都有一定的范圍，選擇凝膠過濾介質(zhì)的關(guān)鍵在于選擇合適的分離范圍，其次要考慮介質(zhì)的機械性能和可放大性。
• 組群分離（緩沖液置換）：可以從一組較大的分子中去除小分子，或者快速、簡單地進行緩沖液置換，上樣體積一般小于30%CV(Column Volume，柱體積 )；
• 精細分離：去除其他層析方法沒有去除的雜質(zhì)、多聚體等，上樣體積一般為0.5%~5%CV；
• 定性分析：分子量大小及分布的測定等。
離子交換層析是根據(jù)不同生物分子所帶表面電荷性質(zhì)和數(shù)量的差異來分離的一種層析技術(shù)。由于生物分子大都帶有酸性基團和堿性基團，并且可以通過調(diào)節(jié)緩沖液的pH改變其帶電性質(zhì)和數(shù)量，生物分子與帶相反電荷的陰離子交換填料或者陽離子交換填料相結(jié)合后，采用改變流動相中的離子強度或pH，讓結(jié)合弱的先洗脫下來，結(jié)合強的后洗脫下來，從而達到分離純化的目的。
蛋白質(zhì)滴定曲線
每種蛋白質(zhì)都有其獨特的凈電荷與pH的關(guān)系，可以將其顯示為滴定曲線。
注：當分子所在溶液pH小于分子的pI（等電點）時，分子表面凈電荷為正（+）；當分子所在溶液pH大于分子的pI時，分子表面凈電荷為負（-）。
Fig.3 蛋白滴定曲線
Table 1.離子交換層析功能基團
Fig.4 陰離子交換層析過程
• 載量高，適合工業(yè)放大
• 分離效率高，應(yīng)用最廣（約75%的純化流程使用）
缺點
• 需優(yōu)化pH和鹽濃度
• 需高鹽洗脫，不適用于高鹽條件下不穩(wěn)定的樣品
典型應(yīng)用
• 抗體純化中的雜質(zhì)去除（如HCP、DNA）
• 疫苗抗原的精細純化
• 重組蛋白捕獲和精細純化等
疏水作用層析是根據(jù)蛋白表面疏水性的不同，利用蛋白和疏水層析介質(zhì)疏水表面可逆的相互作用來分離蛋白。選擇疏水作用層析填料的關(guān)鍵在于選擇合適疏水強弱的配基，若蛋白質(zhì)的疏水性較強就需要選擇較弱的疏水填料，反之亦然。
Table 2.疏水層析功能基團
疏水作用介質(zhì)疏水性強弱表
Fig.5 疏水作用介質(zhì)疏水性強弱表
Fig.6 疏水層析過程
• 分辨率高
• “高鹽吸附，低鹽洗脫”的特點使其能直接與其他層析分離技術(shù)如鹽析、離子交換等工藝聯(lián)合使用
缺點
• 高鹽易引發(fā)沉淀，需要合理控制鹽濃度
• 對溫度較敏感：層析開始前建議確認樣品、緩沖液、柱子、層析設(shè)備都在相同的溫度
• 洗脫容易拖尾
典型應(yīng)用
• 適用于根據(jù)蛋白疏水性差異分離的捕獲、中度純化和精細純化
• 抗體聚體及片段去除
• ADC純化中的雜質(zhì)去除
親和層析：識別“特異性結(jié)合”
原理
親和層析是一種根據(jù)生物分子之間的特異相互作用來分離物質(zhì)的層析方法，如酶和底物的結(jié)合、受體和配體的結(jié)合、抗體和抗原的結(jié)合等。這類結(jié)合既是特異的，又是可逆的。通過這種可逆的結(jié)合和分離來達到蛋白純化的目的。親和層析具有高選擇性的特點，可快速從復(fù)雜體系中捕獲目的蛋白，通常一步純化就能達到90%以上的純度。
Table 3.親和層析常見配基與底物
Fig.7 親和填料結(jié)構(gòu)
• 基架：多孔球形，使配基附著在基質(zhì)上，具有理化惰性；
• 間隔臂：克服可能存在的空間位阻效應(yīng)，改善配基與目標分子的結(jié)合；
• 親和配基：可逆地結(jié)合特定目標分子或目標基團的分子。
優(yōu)點vs缺點
• 特異性強，一步純化后純度可達90%以上
• 操作簡便，適合作為第一步捕獲工藝
缺點
• 填料單價相對其他層析填料較高
• 配基脫落風(fēng)險需控制
典型應(yīng)用
• 單抗/雙抗生產(chǎn)的初步捕獲
• 標簽蛋白純化
總結(jié)
層析純化技術(shù)構(gòu)建了現(xiàn)代生物制藥工藝的“中流砥柱”，而層析填料就是這個工藝階段的關(guān)鍵構(gòu)件。理解層析原理，是掌握純化技術(shù)的第一步。未來，我們還將深入解析不同類型填料的選擇技巧、工藝優(yōu)化思路以及真實案例分享，敬請期待！
