強(qiáng)迫游泳、懸尾和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)相關(guān)-溫陽(yáng)解郁湯對(duì)抑郁模型大鼠HPA軸的影響

溫陽(yáng)解郁湯對(duì)抑郁模型大鼠HPA軸的影響

摘要：目的：研究溫陽(yáng)解郁湯對(duì)慢性應(yīng)激抑郁大鼠HPA軸的影響，初步探討其抗抑郁作用的機(jī)制。方法：雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為6組，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃0.9%氯化鈉溶液，溫陽(yáng)解郁湯高、中、低劑量組灌胃溫陽(yáng)解郁湯濃縮煎劑（8、6、4g/kg）、陽(yáng)性藥對(duì)照組灌胃鹽酸氟西�。�3.33mg/kg），除正常對(duì)照組外其余各組在灌胃同時(shí)接受慢性不可預(yù)知溫和刺激（CUMS）刺激并孤養(yǎng)28d。采用強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（FST）、懸尾實(shí)驗(yàn)（TST）、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（OFT）對(duì)各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)價(jià)；q PCR檢測(cè)大鼠下丘腦CRH m RNA和海馬GR m RNA的表達(dá)；放射免疫法檢測(cè)大鼠血中ACTH、CORT的含量；HE染色大鼠海馬觀察組織形態(tài)變化。結(jié)果：溫陽(yáng)解郁湯能夠減少大鼠FST和TST不動(dòng)時(shí)間，增加OFT穿格次數(shù)（P<0.05）；能夠降低由慢性應(yīng)激引起的CRH、GR、ACTH、CORT水平升高（P<0.05），并能減少海馬組織損傷。結(jié)論：溫陽(yáng)解郁湯能夠改善CUMS大鼠的應(yīng)激抑郁行為和慢性應(yīng)激時(shí)高糖皮質(zhì)激素對(duì)大腦的損害，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)HPA軸有關(guān)。

關(guān)鍵詞：溫陽(yáng)解郁湯；抑郁癥；下丘腦-垂體-腎上腺軸

抑郁癥作為一種特殊的精神疾病，具有一系列廣泛的癥狀，包括快感缺乏、無(wú)助、悲傷和絕望，并且被認(rèn)為是與環(huán)境（例如應(yīng)激或創(chuàng)傷）和遺傳因素有關(guān)。當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，機(jī)體通過(guò)調(diào)節(jié)交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)和下丘腦-垂體-腎上腺軸（hypothalamic pituitary gonadal axis，HPA）使機(jī)體獲得穩(wěn)定、恢復(fù)穩(wěn)態(tài)，一定程度的應(yīng)激對(duì)機(jī)體是有益的，但是長(zhǎng)期應(yīng)激，則可以引起抑郁癥的發(fā)生。HPA軸是重要的內(nèi)分泌軸，是神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)的樞紐，對(duì)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡起著至關(guān)重要的作用。研究表明，抑郁癥的發(fā)生與HPA軸功能的紊亂有密不可分的關(guān)系。中醫(yī)通過(guò)溫補(bǔ)腎陽(yáng)、理氣解郁，對(duì)抑郁癥有很好的治療效果，在抑郁癥的治療中越來(lái)越得到重視。本研究建立經(jīng)典的慢性不可預(yù)知溫和刺激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）抑郁大鼠模型，研究溫陽(yáng)解郁湯對(duì)抑郁模型大鼠HPA軸的影響，探究該方抗抑郁的機(jī)制。

材料與方法

1.  材料  180只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，初始體質(zhì)量150-180g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：11400700073683。鹽酸氟西汀分散片購(gòu)自西班牙禮來(lái)公司，20mg，批號(hào)：4089A；皮質(zhì)醇（cortisol，CORT）和促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）放免試劑盒購(gòu)自北京華英生物技術(shù)研究所；總RNA小量制備試劑盒購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；PCR引物由生工生物工程（上海）有限公司設(shè)計(jì)并合成；2×Easy Taq PCR Super Mix、Trans Script TM Green Two-Step q RT-PCR Super Mix、Trans DNA Marker I均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；其它實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑均由山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

2. 溫陽(yáng)解郁湯濃縮煎劑制備  溫陽(yáng)解郁湯組成藥物：桂枝、附子各15g，炙甘草10g，生姜、烏梅各30g，大棗5個(gè)；以上藥物按比例稱取，加入藥材重量10倍量70%乙醇溶液提取3次，第1次為1.5h，第2、3次分別為45min，合并提取液，減壓回收乙醇并濃縮至稠膏狀，減壓干燥成干膏并粉碎成細(xì)粉，過(guò)80目篩備用。

3. 分組、造模及給藥  將Wistar大鼠首先飼養(yǎng)7d以適應(yīng)環(huán)境，最后1天用Supermaze視頻跟蹤分析系統(tǒng)進(jìn)行Open-field行為學(xué)測(cè)定，選取評(píng)分相近的180只健康雄性大鼠，依照體質(zhì)量隨機(jī)分為6組，每組30只�？瞻讓�(duì)照組和模型對(duì)照組大鼠灌胃0.9%氯化鈉溶液；溫陽(yáng)解郁湯高、中、低劑量組分別灌胃溫陽(yáng)解郁湯濃縮煎劑8、6、4g/kg（相當(dāng)于生藥18.6、27.9、37.2g/kg）；陽(yáng)性藥對(duì)照組灌胃鹽酸氟西�。�3.33mg/kg）。各組灌胃容量均為0.2m L/10g，灌胃28d。除正常對(duì)照組外，其余各組灌胃同時(shí)采用CUMS結(jié)合孤養(yǎng)刺激。選用夾尾（1min）、噪音（1h）、閃光（1h）、冰水游泳（4℃，5min）、潮濕墊料（100m L，24h）、傾斜籠具（30°，24h）、晝夜顛倒、禁食、禁水9種溫和刺激，于每日9：00和16：00隨機(jī)安排刺激方法，刺激28d。第29天進(jìn)行行為學(xué)評(píng)價(jià)、取材和指標(biāo)測(cè)定。

4. 大鼠行為學(xué)評(píng)價(jià)  本實(shí)驗(yàn)采用的以下行為學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器均購(gòu)自上海欣軟信息科技有限公司，強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（forced swim test，F(xiàn)ST）：大鼠游泳6min，記錄后4min內(nèi)的累計(jì)不動(dòng)時(shí)間；懸尾實(shí)驗(yàn)（tail suspension test，TST）：大鼠夾尾懸掛6min，記錄后4min內(nèi)累計(jì)不動(dòng)時(shí)間；曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（open field test，OFT）：在敞箱內(nèi)記錄大鼠5min內(nèi)測(cè)定運(yùn)動(dòng)格數(shù)和理毛次數(shù)。

5. 血清CORT和ACTH水平的測(cè)定  行為學(xué)評(píng)價(jià)之后，每組取20只大鼠測(cè)定其血清CORT和ACTH水平。將大鼠迅速腹主動(dòng)脈取血，置于離心管內(nèi)，4℃ 4  000r/min離心10min，取血清，-20℃保存待測(cè)。采用放射免疫法檢測(cè)CORT和ACTH的含量。

6.  大鼠下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotropin-releasing hormone，CRH）m RNA及海馬糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR） m RNA表達(dá)水平  取血結(jié)束后，每組取10只大鼠，于冰盤中急速開(kāi)顱取腦，剝離大腦下丘腦和海馬，-70℃保存。分別提取下丘腦和海馬總RNA，RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄為c DNA。采用q PCR法檢測(cè)下丘腦CRH m RNA及海馬GR m RNA表達(dá)水平。根據(jù)Genbank中大鼠基因序列設(shè)計(jì)引物，CRH引物：上游：5’-AGC CGC CCA TCT CTC TGG ATC TC-3’，下游：5’-TCC CGA TAA TCT CCA TCA GTT-3’；GR引物：上游：5’-GAT TGA ACC CGA GGT GTT GTA TGC-3’，下游：5’-CGG CAA ATG CCA TGA GAA ACA TCC-3’；β-actin引物：上游：5’-GAG ACC TTC AAC ACC CCA GC-3’，下游：5’-ATG TCA CGC ACG ATT TCC C-3’。讀取Ct值，采用2-ΔΔCt計(jì)算CRH m RNA的相對(duì)表達(dá)水平。

7. 大鼠海馬蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色  行為學(xué)評(píng)價(jià)之后，每組取10只大鼠進(jìn)行海馬組織HE染色。使用4%多聚甲醛心臟灌流法內(nèi)部去血固定大鼠腦組織，開(kāi)顱取腦，石蠟包埋，冠狀切片。取海馬組織切片進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察海馬組織病理變化。

8. 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均在SPSS 19.0軟件包上進(jìn)行。計(jì)量資料以x-±s表示，組內(nèi)比較使用配對(duì)t檢驗(yàn)，組間比較使用方差分析。計(jì)數(shù)資料采用構(gòu)成比，組間比較用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

討論

抑郁癥作為一種多因素引起的精神疾病，與HPA軸功能失調(diào)有關(guān)，而以HPA軸為靶點(diǎn)的藥物能夠起到治療抑郁癥的作用。近年來(lái)，采用中醫(yī)溫陽(yáng)解郁理論治療抑郁癥的研究屢見(jiàn)報(bào)道。中醫(yī)理論強(qiáng)調(diào)“陽(yáng)主動(dòng)”，腎陽(yáng)作為一身元陽(yáng)之根，主宰身之陽(yáng)氣，而抑郁癥臨床總體以情緒低落、思維遲緩、主動(dòng)性下降等“不動(dòng)”表現(xiàn)為主，因此陽(yáng)氣不足與抑郁癥發(fā)病存在密切關(guān)系�！端貑�(wèn)·生氣通天論》曰：“陽(yáng)氣者，若天與日，失其所折壽而不彰，故天運(yùn)當(dāng)以日光明”，“陽(yáng)氣者，精則養(yǎng)神，柔則養(yǎng)筋”。強(qiáng)調(diào)了人體生命活動(dòng)均有賴于陽(yáng)氣的推動(dòng)和溫煦作用，使人體陰陽(yáng)相對(duì)平衡協(xié)調(diào)。溫陽(yáng)解郁湯由鄭欽安《醫(yī)法圓通》之補(bǔ)坎益離丹化裁而來(lái)，方中“附子辛熱，能補(bǔ)坎中真陽(yáng)，真陽(yáng)為君火之種，補(bǔ)真火即是補(bǔ)君火也”，同時(shí)上助心陽(yáng)、中溫脾陽(yáng)；桂枝、生姜辛通心陽(yáng)，疏肝氣，溫肝陽(yáng)，補(bǔ)肝用；炙甘草、大棗甘緩其中，合辛甘化陽(yáng)、酸甘化陰之意，同時(shí)“甘草補(bǔ)中有引火歸根之妙”，生姜、大棗溫中焦，助脾陽(yáng)，烏梅統(tǒng)領(lǐng)陽(yáng)藥入肝，溫補(bǔ)肝陽(yáng)，使肝中陽(yáng)氣得以升發(fā)，又可斂肝氣、養(yǎng)肝血以柔肝，正合肝“體陰而用陽(yáng)”的生理特性。諸藥合用，復(fù)腎陽(yáng)、補(bǔ)肝陽(yáng)、暖心陽(yáng)、運(yùn)脾陽(yáng)，收納微陽(yáng)于腎，伏虛火于中，切合抑郁癥之病機(jī)。

本研究中構(gòu)建的CUMS動(dòng)物模型能夠表現(xiàn)出與抑郁癥患者相似的行為和激素水平的改變。采用FST、TST和OFT進(jìn)行本方對(duì)大鼠行為影響的評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示：模型對(duì)照組大鼠FST、TST不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，OFT穿格次數(shù)減少，與Cheng R F等研究結(jié)果相符；灌胃溫陽(yáng)解郁湯濃縮煎劑后CUMS大鼠的行為遲滯現(xiàn)象得到改善，提示本研究選用的溫陽(yáng)解郁方劑能夠起到緩解CUMS大鼠應(yīng)急抑郁癥狀的作用。

本研究亦對(duì)HPA軸相關(guān)激素表達(dá)和分泌水平進(jìn)行檢測(cè)，HPA軸由下丘腦、腺垂體和腎上腺皮質(zhì)及其分泌的CRH、ACTH和CORT組成，當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，HPA軸處于亢奮狀態(tài)，其中CORT發(fā)揮調(diào)節(jié)機(jī)體應(yīng)對(duì)應(yīng)激的作用，CORT同時(shí)作用于下丘腦和海馬的GR，下調(diào)CRH的分泌，從而下調(diào)HPA軸整體激素水平，使之恢復(fù)到基礎(chǔ)狀態(tài)。長(zhǎng)期的慢性應(yīng)激狀態(tài)下，過(guò)量CORT持續(xù)刺激GR，使GR與CORT結(jié)合能力下降，負(fù)反饋調(diào)節(jié)能力下降，導(dǎo)致HPA軸持續(xù)興奮。此外，持續(xù)高水平的CORT會(huì)導(dǎo)致海馬神經(jīng)元受損。研究顯示：溫陽(yáng)解郁湯能夠下調(diào)CRH、ACTH和CORT的水平，減少應(yīng)激時(shí)高糖皮質(zhì)激素對(duì)大腦的損害效應(yīng)，提示該方劑可能通過(guò)調(diào)節(jié)HPA軸發(fā)揮抗抑郁作用。另外，該方劑能夠恢復(fù)抑郁大鼠海馬GR表達(dá)水平，提示該方劑通過(guò)保護(hù)海馬進(jìn)而穩(wěn)定HPA軸負(fù)反饋調(diào)節(jié)功能，這與岳廣欣等的研究結(jié)果相符。作為情感調(diào)節(jié)中樞重要的組成部分，其組織功能受損就可能引發(fā)抑郁癥。本研究中，海馬組織HE染色結(jié)果顯示：溫陽(yáng)解郁湯濃縮煎劑在下調(diào)HPA軸激素水平的同時(shí)能夠起到保護(hù)海馬組織的作用。因此，溫陽(yáng)解郁湯改善抑郁癥狀可能與保護(hù)海馬組織負(fù)反饋調(diào)節(jié)HPA軸能力，下調(diào)HPA軸激素水平有關(guān)，其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。