使用Tempest搭配DropArray™“的“無壁“ 孔板進行高通量細胞測定

高效的高通量篩選是一個包含樣品、化學(xué)、自動化和數(shù)據(jù)分析的復(fù)雜系統(tǒng)。傳統(tǒng)的高通量系統(tǒng)利用6至1536孔板來支持產(chǎn)生可靠且具有統(tǒng)計學(xué)意義研究所需的大量實驗條件。當(dāng)前的技術(shù)需要大量投資在樣品和試劑上，并且根據(jù)正在研究的細胞類型，其應(yīng)用也會受到限制。

例如，多步驟處理（例如多次洗滌）的研究通常需要貼壁細胞，而懸浮細胞非常適合不需要洗滌（例如添加、混合、讀�。┑木�質(zhì)測定。在這里，我們展示了一個獨特的系統(tǒng)，該系統(tǒng)將 Curiox Biosystems 的 DropArray™ 板與 Formulatrix Tempest 的非接觸式、低容量自動液體分配相結(jié)合，用于自動處理貼壁細胞和懸浮細胞。

關(guān)于CURIOX BIOSYSTEMS DROPARRAY™ 微孔板
DropArray™微孔板通過利用板平面表面的疏水性和親水性特性實現(xiàn)“無壁”液滴分離。以網(wǎng)格圖案排列在疏水基底上的親水島使分配的液滴“聚集”并保持樣品之間的分離。將液滴分配到特殊涂層的表面后，將不混溶的液體蓋密封液添加到板中，以防止交叉污染和液體蒸發(fā)。有關(guān)詳細信息，請參閱 http://www.curiox.com/products.html。

關(guān)于 FORMULATRIX TEMPEST
Formulatrix Tempest是一款基于專有模塊化微流控芯片技術(shù)的非接觸式批量試劑分配器。它可配置為通過96個單獨控制的通道同時輸送多達12種成分的任何體積。DropArray技術(shù)得益于Tempest液體分配器的X-Y空間精度和精確的非接觸式分配功能。 Tempest獲得專利的微流體閥組使用正排量將離散體積的液體分配到96、384或1536孔板，且其不可回收死體積低至50µL�？蛇x的堆疊器和條形碼閱讀器為儀器增加了額外的靈活性。

FORMULATRIX

TEMPEST

方法和材料
I. 細胞系和試劑
COS-7 (非洲綠猴成纖維細胞樣腎細胞) 和人類前列腺上皮 (hPRE) 細胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，并根據(jù) ATCC 建議進行培養(yǎng)。通過使用CD8+ T 細胞分離試劑盒 (130-094-156; Miltenyi Biotec) 從隨機健康供體的外周血中分離出人外周血單個核細胞 (PBMC) ，再從中純化細胞毒性 T (CD8+ T) 細胞。

使用的抗體和染色劑如下：單克隆抗體 APC 小鼠抗人CD8（555369；BD Biosciences）、Hoechst 33342 核酸染色劑（H-3570；Molecular Probes）、鬼筆環(huán)肽-四甲基羅丹明 B 異硫氰酸酯（P1951；Sigma-Aldrich） )、ZO-1 兔多克隆抗體 (61-7300;  Invitrogen) 和 Alexa Fluor ® 488 標(biāo)記的羊抗人 IgG (H+L) 抗體(A-11013; Invitrogen)。 

抗 CD3/CD19 雙特異性抗體產(chǎn)生于中國倉鼠卵巢細胞，并如前所述從細胞培養(yǎng)上清液中純化 (1)。內(nèi)吞抑制劑 Dynasore 水合物 (D7693; SigmaAldrich) 用于實時成像應(yīng)用。

使用了以下細胞活性測定試劑：CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (G7570; Promega)、CellTracker™ Green CMFDA (5-Chloromethylfluorescein Diacetate) (C7025; CMFDA; Molecular Probes)、溴化乙錠溶液 (EB; E1510; Sigma-Aldrich）、吖啶橙鹽酸鹽水合物熒光染料（AO；318337；Sigma-Aldrich）和碘化丙啶復(fù)染劑（PI；P3566；Molecular Probes）。

II. 細胞轉(zhuǎn)染
按照制造商的標(biāo)準方案，通過使用FuGENE®6轉(zhuǎn)染試劑（E2691；Promega）以6µL的體積：在 OPTIMEM（31985-070；Invitrogen）中稀釋的(1µgDNA，用互補DNA（cDNA）轉(zhuǎn)染COS-7細胞。細胞在染色前培養(yǎng)48小時。

III. 細胞活性測定
在進行特異性細胞活力測定之前，用不同濃度的單甲基 auristatin E (MMAE)（一種合成抗腫瘤劑）處理細胞 72 小時。對于 CellTiter-Glo® 測定，將 2 µL CellTiter-Glo® 液滴添加到 DropArray™ 板上的 2 µL 細胞液滴中。在室溫下培養(yǎng) 5 分鐘后，在 EnVision 2102 Multilabel Plate Reader (Perkin Elmer) 上讀取板。

對于基于熒光的分析，細胞用添加了 MMAE 的CellTracker™ Green CMFDA 進行標(biāo)記。洗滌液滴以去除死細胞和細胞碎片，然后用 IN CELL Analyzer 2000 (GE Healthcare Life Sciences) 對板進行成像并使用 IN CELL Developer Toolbox v1.9 圖像分析軟件進行分析。

IV. 免疫熒光染色
細胞用 4% 多聚甲醛固定 20 分鐘，用 1X 磷酸鹽緩沖液 (PBS) 洗滌，然后用 PBS/1% 牛血清白蛋白(BSA) 封閉 30 分鐘。

將細胞與 Fc 標(biāo)記的誘餌蛋白或人特異性抗體在 PBS/1% BSA 中培養(yǎng) 1 小時，用 1X PBS 洗滌并與適當(dāng)?shù)臒晒鈽?biāo)記的二抗在室溫下培養(yǎng) 45 分鐘，然后用 1X PBS 洗滌 并成像。

V. 自動化設(shè)備
除了 Curiox Biosystems 洗板機之外，用于處理 Curiox Biosystems DropArray™ 板的完整自動化系統(tǒng)還包括控制Formulatrix Tempest、Dynamic Devices Oasis 和 Peak Analysis & Automation KiNEDx 機器人的 Overlord3 調(diào)度軟件。該系統(tǒng)通過各種免疫化學(xué)、轉(zhuǎn)染和細胞活性測定來處理貼壁和懸浮細胞，減少反應(yīng)體積，同時產(chǎn)生可靠的數(shù)據(jù)。

結(jié)果
傳統(tǒng)384孔板 vs. DropArray™ 板
DropArray™ 無壁孔板可實現(xiàn) 在384 孔板上的小體積貼壁和懸浮細胞培養(yǎng)。覆蓋 2 µL 細胞培養(yǎng)基液滴的培養(yǎng)油可避免蒸發(fā)并實現(xiàn)長期細胞培養(yǎng)條件（圖 1）。

使用 DropArray™ 技術(shù)對懸浮細胞和貼壁細胞進行細胞活性測定 
使用 Tempest 和 DropArray™ 技術(shù)測試了幾種細胞活性測定。使用標(biāo)準 384-ul 板將反應(yīng)體積減少到總共 4 µL（2 µL 細胞和 2 µL CellTiter-Glo®），而不是40 µl（20 µL 細胞和 20 µL CellTiter-Glo®），與使用CellTracker™ Green CMFDA 進行熒光活細胞染色相比，得出的半最大抑制濃度 (IC50)（圖 2）非常接近。這些結(jié)果表明，與需要較大體積試劑的傳統(tǒng)微孔板式方法相比，低體積的培養(yǎng)和測定條件產(chǎn)生了類似的結(jié)果。

圖 2. 洗滌細胞（熒光檢測）和不洗滌細胞（發(fā)光檢測）產(chǎn)生類似的 IC50 曲線。

使用 DropArray™ VS微量滴定板進行細胞-表面蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究
DropArray™ 板在基于細胞的多步驟測定程序中的性能通過表達克隆實驗進行分析，以研究 IgLON 家族成員的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。使用優(yōu)化的洗滌條件 (2)，DropArray™ 技術(shù)與使用常規(guī)自動洗滌程序的傳統(tǒng) 384 孔板進行了比較。用邊緣系統(tǒng)相關(guān)膜蛋白(LSAMP) 瞬時轉(zhuǎn)染 COS-7 細胞（貼壁）、人胚腎 293T (HEK-293T) 細胞（半貼壁）和HEK-293S 細胞（懸浮適應(yīng)）， 人類神經(jīng)營養(yǎng)因子 (hNT) 或阿片樣物質(zhì)結(jié)合蛋白/細胞粘附分子樣 (OPCML) 構(gòu)建體。

然后將表達 LSAMP、hNT 或 OPCML 的細胞與誘餌蛋白一起培養(yǎng)。使用 Alexa Fluor ® 488 標(biāo)記的羊抗人IgG (H+L) 抗體檢測 NEGR1-hFc 結(jié)合。與任一板格式的非轉(zhuǎn)染細胞中的非特異性結(jié)合相比，觀察到響應(yīng)于 NEGR1-hFc 與 LSAMP、hNT 或 OPCML 的特異性結(jié)合，平均強度增加了 5 倍（圖 3B）。

圖 3. 基于細胞的細胞外蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。(A) 用 hNT 或 OPCML 表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的 COS-7 細胞被固定并與 NEGR1-hFc 誘餌蛋白一起培養(yǎng)。用抗人 AF488（綠色）洗滌和染色細胞，并用 IN Cell Analyzer 2000 掃描。在標(biāo)準 384 孔微量滴定板和DropArray™ 板中使用相同的試劑進行轉(zhuǎn)染和染色，以進行直接比較。通過使用核的赫斯特染色（藍色）在兩種板格式中測量相似的細胞密度。比例尺 = 70 µm。 (B) 量化了采集圖像中綠色通道的平均強度。當(dāng) NEGR1-hFc 與表達 NEGR1 結(jié)合配偶體的三種不同表達構(gòu)建體的三種不同細胞類型結(jié)合時，觀察到類似的強度值。以標(biāo)準 384 孔板形式培養(yǎng)的貼壁細胞系 (COS7) 產(chǎn)生了類似的值，但在標(biāo)準 384 孔板形式的洗滌過程中去除了弱貼壁 (293T) 和懸浮適應(yīng) (293S) 細胞系。

在 384 孔板中未檢測到 NEGR1-Fc 與 LSAMP、hNT 或 OPCML 轉(zhuǎn)染的HEK293T或 S 細胞的結(jié)合，因為這些半貼壁和懸浮適應(yīng)細胞在洗滌過程中被去除（圖 3B）。然而，使用 DropArray™ 板和優(yōu)化的洗滌條件處理細胞導(dǎo)致 NEGR1-Fc 與LSAMP、HNThNT 或 OPCML 轉(zhuǎn)染的 HEK-293T 或HEK-293S 細胞結(jié)合，類似于 COS-7 細胞。

384 孔板與 DropArray™ 板每運行 40 次的體積差異
DropArray™ 板和 Tempest 液體分配器系統(tǒng)使轉(zhuǎn)染實驗中使用的大多數(shù)試劑減少了 10 倍（表 1），從而顯著減少了試劑體積并顯著節(jié)省了每個樣品的成本。每個樣本的成本降低使得完成檢測的成本更低，并根據(jù)給定研究的總成本增加了可訪問性。

表 1. DropArray™/Tempest 系統(tǒng)減少了試劑的使用量。將DropArray™ 板與 Tempest 液體分配器結(jié)合使用，可將所需的轉(zhuǎn)染試劑減少 90%。

總結(jié)
高通量篩選的挑戰(zhàn)是以最少的成本和精力有效地收集足夠的可靠數(shù)據(jù)。在這里，我們提出了新的儀器和實驗室用具，這些儀器和用具減少了處理貼壁和非貼壁培養(yǎng)細胞的同質(zhì)化測定、免疫熒光測定和轉(zhuǎn)染的成本和工作。利用Formulatrix Tempest和Curiox Biosystems的DropArray™板收集的數(shù)據(jù)與使用標(biāo)準384孔板獲得的類似數(shù)據(jù)相比更有優(yōu)勢，但卻節(jié)省了大量的試劑，因此也節(jié)省了成本。集成自動化平臺包括控制Formulatrix Tempest、Dynamic Devices Oasis和PAA KiNEDx機器人的Overlord3調(diào)度軟件。這個平臺提供了一個強大而可靠的系統(tǒng)，可以對貼壁、半貼壁和懸浮細胞進行基于細胞的測定，大幅減少試劑，同時保有傳統(tǒng)高通量篩選板格式獲得的結(jié)果質(zhì)量。