細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)菌污染專治方法詳解
1677年荷蘭博物學(xué)家安東尼·范·列文虎克 （Antonie van Leeuwenhoek） 借助原始顯微鏡（類似于現(xiàn)代放大鏡）首次發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌。細(xì)菌的個體非常小，細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡單，無細(xì)胞核、細(xì)胞器，目前已知最小的細(xì)菌只有0.2 μm。細(xì)菌廣泛分布于土壤和水中，或者與其他生物共生。人體上也帶有相當(dāng)多的細(xì)菌，據(jù)估計(jì)，人體內(nèi)及表皮上的細(xì)菌細(xì)胞總數(shù)約是人體細(xì)胞總數(shù)的十倍。
01基礎(chǔ)知識
細(xì)菌形態(tài)：
細(xì)菌可以呈現(xiàn)三種基本形狀之一：球形（球菌）、桿狀（芽孢桿菌）或彎曲（弧菌、螺菌）。例如，一些球菌會成對存在，大多數(shù)鏈球菌類似于一長串珠子，而葡萄球菌則形成隨機(jī)團(tuán)塊（“葡萄球菌”這個名字來源于希臘語staphyle，意思是“葡萄簇”）。此外，一些球菌以方形或立方體團(tuán)塊形式出現(xiàn)。桿菌通常單獨(dú)出現(xiàn)，但有些菌株會形成長鏈，例如棒狀桿菌，經(jīng)常以任意角度相互連接。有些桿菌的末端是尖的，而另一些桿菌的末端是方形的。還有些桿狀桿彎曲成逗號形狀通常被稱為弧菌，包括引起霍亂的霍亂弧菌。其他形狀的細(xì)菌包括彎曲的螺旋體，形成類似于開瓶器的螺旋體。
圖二 革蘭氏陽性與陰性的比較（圖源網(wǎng)絡(luò)）
02細(xì)菌污染現(xiàn)象
細(xì)菌在適宜的條件下會快速增殖，因此細(xì)菌污染的進(jìn)程一般很快，有的在培養(yǎng)箱過夜便可觀察到培養(yǎng)液渾濁，同時因?yàn)榧?xì)菌的代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)使培養(yǎng)液的pH下降變黃。在顯微鏡下，會發(fā)現(xiàn)細(xì)沙狀/桿狀/球狀的黑點(diǎn)均勻密集分布，有的甚至?xí)a(chǎn)生異樣的氣味。
下面讓我們通過一些圖片來進(jìn)一步具象化細(xì)菌污染吧！
圖三 左側(cè)為正常培養(yǎng)基顏色，右側(cè)為細(xì)菌污染后的培養(yǎng)基，可明顯發(fā)現(xiàn)變黃、渾濁。（圖源客戶）
圖四 細(xì)菌污染初期培養(yǎng)基粉紅色，略帶渾濁。（圖源客戶）
圖五 細(xì)菌污染可能造成細(xì)胞增殖緩慢或形態(tài)上的改變（多角、多核等），細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生空泡、細(xì)胞不附著。（圖源客戶）
圖六 細(xì)菌污染嚴(yán)重時，顯微鏡下觀察呈細(xì)沙狀，放大倍數(shù)仔細(xì)觀察可以見黑點(diǎn)會存在均一的細(xì)菌形態(tài)如桿狀、球狀、彎曲等。（需要區(qū)別于血清沉淀，血清沉淀通常形態(tài)不一）
03 細(xì)菌污染的防治
細(xì)菌的克星：抗生素
又稱為抗菌素，是指由微生物（包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬）或高等動植物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其他活性的一類次級代謝產(chǎn)物，能干擾其他生活細(xì)胞發(fā)育功能的化學(xué)物質(zhì)。抗生素等抗菌劑的抑菌或殺菌作用，主要是針對“細(xì)菌有而人（或其他動植物）沒有”的機(jī)制進(jìn)行殺傷，包含四大作用機(jī)理，即：抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成，增強(qiáng)細(xì)菌細(xì)胞膜通透性，干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)合成以及抑制細(xì)菌核酸復(fù)制轉(zhuǎn)錄。
抗生素的作用具有選擇性，不同抗生素對不同病原菌的作用不一樣。對某種抗生素敏感的病原菌種類稱為該抗生素的抗生譜（抗菌譜）。僅對單一菌種或?qū)儆锌咕饔�，這類抗生素稱為窄譜抗菌素，如青霉素的抗菌譜主要包括革蘭氏陽性菌和某些陰性球菌，鏈霉素的抗菌譜主要是部分革蘭氏陰性桿菌。在細(xì)胞培養(yǎng)中，為了起到預(yù)防的作用我們常加入1%的青鏈雙抗（C3420-0100），抗生素聯(lián)合使用目的是減少細(xì)菌耐藥性，擴(kuò)大抗菌范圍。但是雙抗并不是營養(yǎng)體系，有研究證實(shí)抗生素會影響某些細(xì)胞的增殖和細(xì)胞代謝等，因此在無菌條件良好的情況下，無需添加。
圖七 某些抗生素的抑菌原理[1]
想“對癥用藥”需要菌種鑒定
可以提取細(xì)菌基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增測序之后，與GeneBank或者Eztaxon對比即可。一般序列相似度在99%以上就可以認(rèn)為是同一個種細(xì)菌（當(dāng)然也有例外，DNA序列僅僅是一個參考指標(biāo)）。常規(guī)鑒定內(nèi)容有形態(tài)特征和理化特性。形態(tài)特征包括顯微形態(tài)和培養(yǎng)特征；理化特性包括營養(yǎng)類型、碳氮源利用能力、各種代謝反應(yīng)、酶反應(yīng)和血清學(xué)反應(yīng)等。
在細(xì)胞培養(yǎng)過程中除了添加抗生素我們應(yīng)該做好以下工作
污染后處理：
●及時丟棄發(fā)生污染的細(xì)胞
●對環(huán)境進(jìn)行消殺，紫外線滅菌、消毒液擦拭培養(yǎng)箱、工作臺等
●檢查所有用過的相關(guān)試劑是否發(fā)生污染，條件允許的情況下可以開封新試劑使用
對于重要且污染相對較輕的細(xì)胞：可以考慮先用含有5%-10%的雙抗的PBS進(jìn)行多次清洗，再用含5%-10%的抗生素的培養(yǎng)基用藥 24h-48h小時，換液使用含有2-3%的抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，最后再換回常規(guī)的含1%雙抗的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，期間要隨時觀察細(xì)胞的狀態(tài)。但需要注意的是：一旦發(fā)生污染后再使用抗生素常常難以根除，另有研究表明，高濃度抗生素可能對細(xì)胞有負(fù)面影響。
預(yù)防大于處理：
在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過程中，我們不希望看到任何微生物污染的情況發(fā)生。為了避免浪費(fèi)有限的精力和資源，應(yīng)優(yōu)先預(yù)防污染的發(fā)生。因此我們在細(xì)胞培養(yǎng)過程中需要遵循無菌技術(shù)的所有準(zhǔn)則，包括無菌工作區(qū)、無菌試劑、良好的個人衛(wèi)生和無菌處理等。當(dāng)然，最最最重要的是我們要擁有足夠且正確的知識和意識，才能夠輕松應(yīng)對細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)生的種種情形。
參考文獻(xiàn)：
[1] Kapoor G, Saigal S, Elongavan A. Action and resistance mechanisms of antibiotics: A guide for clinicians. J Anaesthesiol Clin Pharmacol. 2017 Jul-Sep;33(3):300-305.
[2] Kadner, Robert J. Rogers, Kara. "bacteria". Encyclopedia Britannica, 15 Aug. 2024.
