宿主細(xì)胞蛋白殘留檢測的法規(guī)要求和檢測方法解析

宿主細(xì)胞蛋白（HCP）的法規(guī)要求對于確保生物制藥產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性至關(guān)重要。經(jīng)測試，殘留的HCP可能引起不良反應(yīng)，如免疫反應(yīng)，也需要關(guān)注到的是殘留的HCP可能影響藥物的活性，導(dǎo)致藥物效果降低，影響治療效果。這些負(fù)面影響會直接導(dǎo)致藥物的安全性問題，甚至可能對患者的健康產(chǎn)生威脅。例如，某些研究表明，ECP（大腸桿菌多肽）的存在與抗ECP抗體和抗rhGH抗體的產(chǎn)生相關(guān)，可能導(dǎo)致免疫反應(yīng)等。

HCP殘留含量也被認(rèn)為是生物制品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA），是工藝穩(wěn)健性監(jiān)測的重要評價(jià)指標(biāo)，也是產(chǎn)品的重要質(zhì)控指標(biāo)。對于HCP的法規(guī)要求是多層次、多方面的，旨在確保生物制藥產(chǎn)品的安全性、有效性和質(zhì)量。許多國家和地區(qū)的藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)都要求生物藥物在上市前必須進(jìn)行HCP殘留的檢測。這是為了確保藥物的安全性和有效性，滿足法規(guī)要求。制藥企業(yè)應(yīng)嚴(yán)格遵守相關(guān)法規(guī)要求，采用合適的檢測方法和控制策略，確保HCP殘留量在可接受范圍內(nèi)。



1.國際法規(guī)要求：

ICH Q6B指南：國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會（ICH）的Q6B指南指出，需要根據(jù)ICH準(zhǔn)則采用敏感且經(jīng)過驗(yàn)證的有效方法來監(jiān)控殘留的HCP，其殘留量通常要求小于100ppm。

美國藥典（USP）：USP<1132>章節(jié)規(guī)定，用一種靈敏度較高的方法檢測藥品中的HCP，其含量應(yīng)該低于檢測限（通常小于100ppm，即1mg總蛋白中HCP含量應(yīng)小于100ng，也即<0.01%）。

歐洲藥典（EP）：EP 2.6.34中規(guī)定，在生物制品中，HCP的含量應(yīng)當(dāng)小于0.1%。

2.國家/地區(qū)藥典要求：

中國藥典（2020版）：

針對CHO細(xì)胞，HCP殘留需要<0.05%（相當(dāng)于小于500ppm）。

針對E.coli，HCP殘留需要<0.01%。

其他國家：不同國家和地區(qū)的藥典可能有各自的HCP殘留標(biāo)準(zhǔn)，但都旨在確保生物制藥產(chǎn)品的安全性和質(zhì)量。


而在實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)的宿主細(xì)胞蛋白殘留檢測方法如下：

1、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

原理：利用特異性抗體與宿主蛋白結(jié)合，通過測定抗原-抗體反應(yīng)來定量宿主蛋白的殘留水平。

優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，可用于定量檢測。

缺點(diǎn)：需要有針對特定HCPs的抗體，可能產(chǎn)生假陽性或假陰性的結(jié)果。

自動化：可以使用自動化工作站，如Biomek i7，來提高準(zhǔn)確性和檢測通量。


2、二維電泳-質(zhì)譜聯(lián)用法（2D-PAGE-MS）

原理：基于蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)差異進(jìn)行分離，通過質(zhì)譜分析進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。

優(yōu)點(diǎn)：可檢測更廣泛的HCPs，提供全面的蛋白質(zhì)譜。

缺點(diǎn)：操作復(fù)雜，需要較高的技術(shù)水平。


3、多肽映射法

原理：通過蛋白質(zhì)酶切、高效液相色譜、質(zhì)譜等步驟，獲得蛋白質(zhì)的多肽圖譜，進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析。

優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確性高，適用于復(fù)雜樣品的分析。

缺點(diǎn)：操作步驟復(fù)雜，需要較高的技術(shù)水平和專業(yè)設(shè)備。


4、電泳法

包括CIE（毛細(xì)管電泳）、SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳）等。

優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)時(shí)間短、靈敏性高（如CIE）。SDS-PAGE簡便、快速、重復(fù)性好。

缺點(diǎn)：分辨率低（如CIE、SDS-PAGE）、不能精確定量（如SDS-PAGE）。


5、質(zhì)譜法

原理：直接檢測蛋白質(zhì)的質(zhì)量和結(jié)構(gòu)，通過比對目標(biāo)蛋白和宿主蛋白的質(zhì)譜圖譜進(jìn)行定量分析。

優(yōu)點(diǎn)：高靈敏度、高分辨率，可同時(shí)檢測多個宿主蛋白。

缺點(diǎn)：需要復(fù)雜的樣品準(zhǔn)備和數(shù)據(jù)分析過程。


6、生物活性測定法

原理：通過測定宿主蛋白對生物活性的影響來驗(yàn)證殘留。

優(yōu)點(diǎn)：提供宿主蛋白殘留對藥物活性的直接影響信息。

缺點(diǎn)：可能在特定情況下不夠敏感或特異性。


在選擇宿主細(xì)胞蛋白殘留檢測方法時(shí)，需要考慮多個因素，包括所需的靈敏度和準(zhǔn)確性、樣品的復(fù)雜性、以及可用的設(shè)備和技術(shù)水平。通常，結(jié)合多種方法可以確保最終藥物產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性。


今天小貝帶來了

基于ELISA的自動化檢測宿主細(xì)胞蛋白殘留標(biāo)準(zhǔn)化流程——標(biāo)準(zhǔn)化無人值守


更高線性的標(biāo)曲——高精度移液體現(xiàn)
  圖2. 使用CygnusTM CHO HCP ELISA 試劑盒對于自動化再現(xiàn)性的驗(yàn)證。手工和自動化的標(biāo)曲比較結(jié)果如圖二A和B所示，對比R2的數(shù)值自動化動化結(jié)果更好。

穩(wěn)定的結(jié)果保證——高重現(xiàn)性
 
使用Biomek i7自動化工作站完成對不同時(shí)間宿主細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞裂解液的蛋白定量檢測。


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