條件性敲除Clcc1小鼠助力發(fā)現科學界長期尋找的內質網陰離子通道

內質網（ER）是蛋白質生物合成和折疊的場所，也是蛋白質發(fā)生糖基化修飾和裂解的場所。同時，它還是細胞內鈣離子濃度的調節(jié)器，而鈣離子在許多生理過程中發(fā)揮著重要作用，如心臟和肌肉收縮、神經信號傳導、細胞增殖和凋亡等。

內質網通過蘭尼堿受體（RyR）和三磷酸肌醇受體（IP3R）釋放鈣離子，并通過質子泵SERCA回收鈣離子。鈣離子跨內質網膜的流動會帶來電勢變化，需要其他離子來中和這種電荷積累。目前已經證實內質網鉀離子通道TRIC的存在，但一價鉀離子無法同時抵消二價鈣離子釋放產生的電勢差。因此，科學家們推測內質網上同時存在一個陰離子通道，但一直未找到。

近日，清華大學醫(yī)學院賈怡昌團隊、中科院上海藥物研究所高召兵團隊和北京大學第三醫(yī)院樊東升團隊合作，首次證實CLCC1正是內質網定位的氯離子通道的孔道形成組分。它能夠協助內質網的鈣離子釋放并調節(jié)內質網的離子穩(wěn)態(tài)，而CLCC1功能缺失會造成內質網脅迫，并引發(fā)與肌萎縮性側索硬化癥（ALS）相關的病理變化。

這篇題為“Disruption of ER ion homeostasis maintained by an ER anion channel CLCC1 contributes to ALS-like pathologies”的論文于5月4日發(fā)表在《Cell Research》雜志上，并作為研究亮點（Research Highlight）被重點推薦。
 

圖片來源：《Cell Research》
（https://www.nature.com/articles/s41422-023-00798-z）

研究材料與方法
在這項研究中，研究人員使用了293FT細胞和小鼠原代神經元，并構建了多個突變敲入小鼠品系。研究人員還利用賽業(yè)生物提供的Clcc1 floxed小鼠，構建了條件性敲除Clcc1小鼠。他們利用多個探針測定了內質網中的靜息態(tài)氯離子、鉀離子和鈣離子濃度，并利用透射電鏡（TEM）觀察了內質網結構。他們還通過電生理學、鈣成像等一系列實驗驗證了CLCC2突變對功能的影響。

技術路線
01通過單通道電生理檢測確認CLCC1是陰離子通道的孔道形成組分，并發(fā)現抑制鈣離子活性的關鍵殘基
02探究CLCC1如何調節(jié)內質網中氯離子、鉀離子和鈣離子的穩(wěn)態(tài)
03分析與ALS相關的罕見突變如何影響CLCC1通道活性

研究結果
1.CLCC1是內質網上陰離子通道的孔道形成組分
之前的研究發(fā)現，內質網駐留蛋白CLCC1的缺失會造成內質網脅迫和神經退行性變。不過CLCC1與氯離子通道CLIC家族成員的序列相似性很小。在此次研究中，研究人員證實CLCC1定位在內質網膜上，并形成了同源二聚體。將純化的全長mCLCC1蛋白加入脂質雙分子層后，他們發(fā)現CLCC1可以介導陰離子流，但不通透納、鉀、鈣等陽離子。這表明，CLCC1是陰離子通道的孔道形成組分。

研究人員進一步分析后發(fā)現，內質網腔內的高濃度鈣離子會抑制CLCC1通道的活性。為了確定負責鈣離子抑制的關鍵殘基，他們對N端幾個保守的帶負電殘基進行了分析，發(fā)現D25和D181是負責CLCC1通道的鈣離子抑制活性的關鍵殘基。D25E/D181R突變的CLCC1會顯著破壞與鈣離子的結合親和力。

2.CLCC1調節(jié)內質網中多種離子的穩(wěn)態(tài)
為了研究CLCC1是否參與調節(jié)內質網的離子穩(wěn)態(tài)，研究人員使用了內質網定位的比率型氯離子探針（RaMorideER）和比率型鉀離子探針（RaMssiumER）。他們發(fā)現，在敲低293FT細胞的CLCC1后，內質網中的靜息態(tài)氯離子濃度（[Cl^–]_ER）和鉀離子濃度（[K⁺]_ER）升高。通過透射電鏡（TEM）觀察，他們發(fā)現對照組的內質網呈現細長結構，而CLCC1敲低后內質網則呈現短而粗的形態(tài)，且內質網的平均寬度增加（圖1）。這些結果表明，CLCC1維持著內質網中氯離子和鉀離子濃度以及內質網的形態(tài)。
 

CLCC1的缺失導致靜息態(tài)[Cl^–]_ER和[K⁺]_ER升高以及內質網腫脹^[1]

接著，研究人員分析了CLCC1作為內質網的氯離子通道是否參與調節(jié)鈣離子的釋放。他們發(fā)現，CLCC1的敲低不僅顯著降低了ATP誘導的鈣離子釋放幅度和速度，還削弱了細胞質中的鈣震蕩。后續(xù)的分析表明，CLCC1的敲低以劑量依賴性的方式增加了內質網中的鉀離子濃度和內質網容量，并降低了鈣離子濃度，說明CLCC1的劑量對于維持靜息態(tài)鈣離子濃度（[Ca²⁺]_ER）至關重要。

作為許多離子通道的必要輔因子，細胞膜上的酸性磷脂PIP2參與了離子通道功能的調節(jié)。在此，研究人員也發(fā)現，PIP2顯著促進了CLCC1通道的活性，而CLCC1第二個環(huán)內的保守殘基K298是關鍵的PIP2結合位點。突變體K298A和K298E降低了CLCC1的電導率和開放概率。K298A基因敲入小鼠的大腦表現出內質網脅迫，而且脊髓中ChAT+運動神經元數量減少，并表現出嚴重的運動障礙和后腿肌肉無力，這表明K298A突變對通道功能的破壞會促進內質網脅迫和運動神經元丟失。

3.與ALS相關的罕見突變破壞CLCC1通道活性
通過中國ALS患者隊列的外顯子組測序分析，研究人員發(fā)現了CLCC1的8個罕見變異，包括S263R和W267R。與對照相比，帶有S263R或W267R突變的CLCC1增加了內質網中的氯離子濃度，表明S263R和W267R是功能上的有害改變，會破壞通道活性。同時，突變會顯著減少ATP誘導的鈣離子釋放。在S263R和W267R基因敲入小鼠中，研究人員還觀察到錯誤折疊蛋白在丘腦和脊髓中積累，顯示了突變神經元更容易出現內質網脅迫。
 

S263R和W267R突變破壞CLCC1通道功能并促進內質網脅迫^[1]

多個Clcc1功能缺失等位基因的表型比較顯示，體內疾病表型的嚴重程度與CLCC1的劑量有關。10%的K298A雜合小鼠出現了類似ALS的癥狀，表明功能缺失突變以顯性失活的方式誘導了離子通道病。在敲除脊髓ChAT+運動神經元中的Clcc1后，小鼠出現運動神經元減少、內質網脅迫、錯誤折疊蛋白積累以及脊髓ALS特征性病變。

研究結論
總的來說，研究人員首次確定CLCC1是內質網定位的氯離子通道的孔道形成組分，其通道活性受到腔內鈣離子的抑制，但受到PIP2的促進。他們還首次將罕見的CLCC1突變與ALS聯系起來，并證明ALS相關突變會破壞CLCC1通道活性，破壞內質網的離子穩(wěn)態(tài)，并引發(fā)大腦中的內質網脅迫。這些結果意味著，由CLCC1維持的內質網離子穩(wěn)態(tài)的破壞是造成神經退行性疾病的原因之一。

原文檢索：
[1]Guo, L., Mao, Q., He, J. et al. Disruption of ER ion homeostasis maintained by an ER anion channel CLCC1 contributes to ALS-like pathologies. Cell Res 33, 497–515 (2023). https://doi.org/10.1038/s41422-023-00798-z

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品系名稱：
C57BL/6J-Clcc1^em1C/Cya
品系編號：
KOCMP-229725-Clcc1-B6J-VA
產品編號：
S-KO-06288
應用方向：
代謝研究,神經系統(tǒng),眼睛,肌肉,生理系統(tǒng),內穩(wěn)態(tài)/代謝,行為/神經
打靶方案：

 

Clcc1條件性基因敲除小鼠

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品系名稱：
C57BL/6J-Clcc1^em1Cflox/Cya
品系編號：
CKOCMP-229725-Clcc1-B6J-VA
產品編號：
S-CKO-07287
應用方向：
代謝研究,神經系統(tǒng),眼睛,肌肉,生理系統(tǒng),內穩(wěn)態(tài)/代謝,行為/神經
打靶方案：