卡非佐米調節(jié)腫瘤微環(huán)境以加強癌癥的免疫檢查點治療

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文獻信息

近日，暨南大學生命科學與技術學院生命與健康工程研究所 廣東省高校功能蛋白研究重點實驗室和教育部腫瘤分子生物學重點實驗室等單位的研究成果“Carfilzomib modulates tumor microenvironment to potentiate immune checkpoint therapy for cancer（卡非佐米調節(jié)腫瘤微環(huán)境以加強癌癥的免疫檢查點治療 ）在雜志EMBO Molecular Medicine（IF：14.260）上發(fā)表。平生公司的活體CT（Supernova）在論文中提供了重要的小鼠肺部腫瘤圖像。

 

該研究的通訊作者陳良、周倩，第一作者為周倩、梁錦霞。

一 文獻背景

PD-1抑制劑對部分癌癥患者的臨床療效令人印象深刻。然而，仍然迫切需要開發(fā)有效的增效劑來擴大其臨床應用。腫瘤相關巨噬細胞（TAM）是一種M2極化巨噬細胞，可消除或抑制T細胞介導的抗腫瘤反應。將TAM轉化為M1巨噬細胞是一種極具吸引力的抗腫瘤治療策略。在這里，作者進行了高通量篩選，發(fā)現卡非佐米能夠有效地驅動M2巨噬細胞表達M1細胞因子，吞噬腫瘤細胞，并向T細胞提供抗原。機制上，卡非佐米誘導未折疊蛋白反應（UPR），激活IRE1a以招募TRAF2，激活NF-κB以轉錄M2巨噬細胞中編碼M1標記物的基因。在體內，卡非佐米通過將TAMs重新編程為M1樣巨噬細胞有效地重新構建了腫瘤微環(huán)境，并在轉基因小鼠模型中縮小了原位肺癌。更重要的是，卡非佐米與PD-1抗體協(xié)同作用，幾乎完全逆轉原發(fā)性肺癌。鑒于卡非佐米在臨床上的安全性，作者的研究表明，卡非佐米與PD-1抑制劑聯合治療實體瘤患者可能會立即得到應用。

 

二 實驗方法

體內腫瘤模型

一個月大的TetO-EGFR T790M/Del19；將CC10rtTA雙轉基因小鼠（指定為TD小鼠）喂食含多西環(huán)素的飲食約12周以誘發(fā)肺癌。肺部腫瘤負荷通過MicroCT（Supernova、SNC-100、平生醫(yī)療科技有限公司）進行監(jiān)測。確認后，將攜帶肺癌的小鼠隨機分為兩組，分別用卡非佐米（3 mg/kg（iv.）每周三次）和每2天一次的抗小鼠PD1抗體（10 mg/kg（ip.））治療，）。治療2周后，再次行CT檢查，并與治療前的標度圖進行比較，評價療效。然后對小鼠實施安樂死。固定肺組織進行病理學分析。同時，研磨腫瘤結節(jié)進行流式細胞術分析。

 

三 實驗結果

卡非佐米在歐洲和美國已被批準用于治療復發(fā)和/或難治性多發(fā)性骨髓瘤（MM）。鑒于作者對其將M2重新編程為M1樣巨噬細胞的能力的觀察，作者假設卡非佐米可以重組腫瘤微環(huán)境，并有助于縮小實體瘤。因此，作者進一步在耐藥EGFR突變體驅動的轉基因小鼠原位肺癌模型中測試了卡非佐米縮小腫瘤的能力。作者在早期工作后，用含多西環(huán)素（Dox）的飲食喂養(yǎng)TetO-EGFR（T790M/Del19）/CC10-rtTA雙轉基因小鼠（指定為TD小鼠），并誘發(fā)肺腺癌。引人注目的是，計算機斷層掃描（CT）顯示卡非佐米治療導致肺部腫瘤顯著消退（圖5A和B）。用克隆體消耗巨噬細胞顯著損害了卡非佐米的腫瘤收縮作用（圖5A和B，以及EV4A和B），表明巨噬細胞在介導卡非佐米的治療效果中發(fā)揮了重要作用。病理分析顯示，這些溶媒處理的小鼠的細胞核形態(tài)高度異質性，細胞核與細胞質的比率，腫瘤細胞沿肺泡排列紊亂，表明這些肺癌的惡性性質。與此形成鮮明對比的是，作者在卡非佐米組的肺中檢測到高度的瘤內間隙和較厚的肺泡壁，這表明原來的腫瘤占位區(qū)域發(fā)生了劇烈的重塑。此外，卡非佐米治療的小鼠的核形態(tài)異質性和核與細胞質的比率明顯較輕（圖5C），病理學證實了卡非佐米的治療效果。引人注目的是，在卡非佐米和克隆體聯合治療的小鼠中，這些作用受到嚴重損害（圖5C和D）。Ki67染色一致顯示，克隆體聯合治療削弱了卡非佐米的腫瘤生長抑制作用（圖5C和D）。

 

作者進一步研究了卡非佐米對體內TAMs的影響，發(fā)現卡非佐米治療使TAMs表達更高水平的CD80，而不是CD86（圖5E和F以及EV4C）。重要的是，卡非佐米治療降低了TME中TAM上CD206的表達（圖5E和F）。綜上所述，這些結果表明，卡非佐米在體內將TAM重新編程為M1樣巨噬細胞。

 

同時，卡非佐米治療增加了腫瘤浸潤CD8+T細胞的百分比。這些CD8+T細胞被激活，因為它們對CD69表達呈陽性（圖5G和H）。值得注意的是，作者觀察到腫瘤浸潤的CD4+T細胞沒有顯著差異（圖EV4D）。為了進一步證實巨噬細胞介導了卡非佐米對突變型EGFR驅動的肺癌的治療作用，作者用CD11B-DTR轉基因小鼠的骨髓重建了致死性照射TD小鼠的免疫系統(tǒng)，然后用含Dox的飲食喂養(yǎng)這些免疫替代小鼠，誘導其發(fā)生原發(fā)性肺癌。白喉毒素（DT）處理可有效清除這些小鼠體內的巨噬細胞（圖EV4E）。用DT處理小鼠后，很大程度上消除了卡非佐米對TD小鼠肺癌的治療作用（圖5I和J）。

 

圖5

A：巨噬細胞在通過卡非佐米介導肺癌萎縮中發(fā)揮作用。用多西環(huán)素飼養(yǎng)TetO-EGFR（T790M/Del19/CC10-rtTA（TD）小鼠3個月以誘導肺癌。然后在治療前通過計算機斷層掃描（CT）成像記錄腫瘤負荷。在用生理鹽水（iv.）、克隆體（iv.）、卡非佐米（iv.）或卡非佐米加克隆體治療2周后，再次對小鼠進行CT掃描（PstRx）。通過ImagJ分析比較PreRx和PstRx的腫瘤面積來確定治療效果。

I：通過CD11B-DTR小鼠骨髓的免疫重建，對巨噬細胞在介導卡非佐米的腫瘤縮小效應中所起作用的基因確認。用X射線照射TD小鼠（8Gy，20min），并移植來自CD11B-DTR小鼠的5×106個骨髓。通過多西環(huán)素飲食誘導免疫替代小鼠發(fā)生肺癌。小鼠用生理鹽水（iv.）、DT（ip.）治療2周，卡非佐米（iv.），或卡非佐米加DT。治療前后通過CT成像記錄腫瘤負荷。

 

作為專業(yè)的抗原呈遞細胞，巨噬細胞積極參與培養(yǎng)T細胞的抗腫瘤免疫。作者發(fā)現，在RAG1-/-不產生功能性T細胞的小鼠（圖6A-C），表明T細胞在這種環(huán)境中起關鍵作用。為了進一步證實這一結果，作者使用抗體刪除TD肺癌轉基因小鼠中的CD8+（圖EV5A-C）或CD4+（圖EV5D和E）T細胞，并發(fā)現在刪除任一群體后，卡非佐米的治療效果顯著受損（圖6D和E，以及EV5F和G）。

PD-1抑制劑已廣泛用于增強T細胞的功能以治療癌癥患者。然而，PD-1抗體未能使大部分癌癥患者受益。例如，驅動因素突變陽性肺癌患者對PD-1抗體治療沒有反應。然后，作者在TD小鼠上測試了PD-1抗體和卡非佐米的聯合治療。與早期報告一致，PD-1抗體單峰治療對這些EGFR突變型肺癌沒有明顯的治療效果（圖6F和G）。引人注目的是，作者發(fā)現卡非佐米與PD-1抗體協(xié)同治療TD小鼠中幾乎完全消退（CR）的肺癌（圖6F和G，以及EV5H和I）。作者還發(fā)現，用卡非佐米和PD-1抗體聯合治療可更有效地激活CD8 T+細胞（圖6H和I）

 

D：CD4+和CD8+T細胞在介導Carfilzomib的抑癌作用中發(fā)揮作用。用生理鹽水、卡非佐米、抗小鼠CD4抗體（ip）治療荷肺癌TD小鼠，抗小鼠CD8抗體（ip），或卡非佐米加抗小鼠CD4/8抗體。治療2周后進行CT掃描。

F：卡非佐米與PD1抗體協(xié)同治療肺癌。用生理鹽水、抗PD1抗體（ip）、卡非佐米或卡非佐米加抗PD1（ip）治療患有肺癌的TD小鼠。治療2周后進行CT掃描。

 

四 文獻結論

以PD-1抑制劑為例的免疫療法在各種晚期癌癥中產生了前所未有的療效和持久的反應。不幸的是，很大一部分患者對這種治療沒有反應。臨床上迫切需要開發(fā)增效劑以擴大PD-1抑制劑的使用。在作者目前的研究中，作者發(fā)現卡非佐米和其他蛋白酶體抑制劑在較小程度上將M2重新編程為M1樣巨噬細胞，從而使更多的CD8+T細胞浸潤并控制體內的腫瘤。作者已經證明，蛋白酶體抑制激活IRE1a以募集TRAF2，并激活NF-jB以轉錄炎性細胞因子和趨化因子，從而為免疫治療創(chuàng)造有利的腫瘤微環(huán)境。更重要的是，卡非佐米與PD-1抗體協(xié)同作用，以縮小突變EGFR引起的肺癌，而突變EGFR對PD-1抗體沒有反應。

 

五 使用設備

Super Nova® Micro CT (平生醫(yī)療科技)

影像軟件: Avatar（平生醫(yī)療科技）