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胰腺癌細胞外泌體構建信號網(wǎng)絡促進腫瘤的進展

瀏覽次數(shù):783 發(fā)布日期:2022-4-20  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

腫瘤異質(zhì)性是癌癥進展和治療抵抗的主要驅(qū)動因素之一。據(jù)推測,癌細胞亞群之間的合作對于維持異質(zhì)性和促進腫瘤進展至關重要。然而,這種合作如何發(fā)生仍然難以捉摸。

細胞外囊泡(EVs)是細胞間通訊的中心介質(zhì)。癌癥EVs具有很多功能,如促進癌癥相關成纖維細胞的分化,增強血管生成,調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫應答,建立轉移前生態(tài)位并賦予非轉移性癌細胞轉移等特性。然而,具有不同表型和腫瘤形成能力的癌細胞亞群之間EVs的交換與交流的問題尚未得到解決。

2022年1月來自葡萄牙波爾圖大學的研究團隊在Gut(IF=23.059)上發(fā)表了題為“Extracellular Vesicles from Pancreatic Cancer Stem Cells Lead an Intratumor Communication Network (EVNet) to fuel tumour progression”的文章,首次揭示了由胰腺癌干細胞(CSC)細胞外囊泡領導的有組織的通信網(wǎng)絡,并展示了其在腫瘤生物學中的重要性。再通過蛋白質(zhì)組學發(fā)現(xiàn)CSC中特異性表達的agrin,通過agrin/LRP-4/YAP通路影響腫瘤進展,并證明了agrin可作為胰腺癌治療干預的潛在新靶點,也可用于預測胰腺癌預后。



 

研究材料
人胰腺癌細胞;胰腺導管腺癌原位模型;患者衍生的異種移植物模型;基因工程小鼠模型;PDAC患者的血清樣本

技術路線
· 步驟1:構建熒光標記EVs的克隆,研究細胞亞群之間EVs的流動;
· 步驟2:改變微環(huán)境,研究EVNet的變化;
· 步驟3:構建動物模型,抑制EVs形成,研究破壞EVNet對腫瘤進展的影響;
· 步驟4:構建模型,比較CSC和NSCC分泌的EVs對腫瘤進展的影響;
· 步驟5:通過蛋白質(zhì)組學研究CSC EVs影響腫瘤進展的原因;
· 步驟6:驗證agrin可作為胰腺癌治療的新靶點;
· 步驟7:發(fā)現(xiàn)并驗證循環(huán)agrin陽性EVs是疾病進展的預后標志物。

研究結果
1. 細胞外囊泡在癌細胞亞群之間自發(fā)流動

首先,研究人員在人胰腺癌細胞中建立了四種不同熒光標記EVs的穩(wěn)定克隆,又基于細胞表面標志物的表達,從每種克隆中分別分選出一種特定的細胞亞群,兩種是以胰腺癌干細胞(CSC,與PADC的不良預后相關)為特征的罕見亞群,CD133+細胞和CD24+CD44+細胞;另外兩種是占據(jù)大多數(shù)的非干細胞(NSCC)亞群,CD24CD44+細胞和4N (CD133CD24CD44EpCAM)細胞。將這四種細胞亞群混合培養(yǎng),通過共聚焦成像分析研究EVs在細胞亞群之間的流動。研究發(fā)現(xiàn),69.56%±11.92%的細胞對其他亞群的EVs呈陽性,表明癌癥EVs在它們之間自發(fā)流動,且流動方向以干細胞(CSC)到非干細胞(NSCC)為主,并排除了分泌的EVs數(shù)量、降解速率或細胞亞群的內(nèi)吞能力的影響。綜上,胰腺癌細胞亞群通過細胞外囊泡的自發(fā)流動,構建了一個有組織的細胞間通訊網(wǎng)絡(EVNet)。



圖1 PDAC癌細胞亞群之間EVs的流動
 

2. EVNet有助于癌細胞適應微環(huán)境
接下來,研究人員探討了改變微環(huán)境的情況下EVNet是否受到影響。結果發(fā)現(xiàn),缺氧使得細胞間的通訊頻率顯著增加,EVs流動方向仍以 (CSC)到(NSCC)為主。而化療引起EVs流動方向改變,非干細胞亞群之間的通訊頻率顯著增加。這表明EVNet是具有可塑性的,在面對微環(huán)境的挑戰(zhàn)時,會改變通訊速度甚至路線。
Rab27a參與細胞外囊泡的形成,敲除Rab27a后,細胞外囊泡分泌減少,缺氧和化療讓胰腺癌細胞死亡比例顯著升高。因此,細胞外囊泡通訊有助于癌細胞適應微環(huán)境變化。



圖2 微環(huán)境改變對EVNet的影響
 

3. 破壞EVNet會阻礙腫瘤生長
為了進一步研究EVNet的生物學作用,研究人員構建了Rab27a功能缺失型胰腺癌鼠模型,發(fā)現(xiàn)通過多四環(huán)素治療的小鼠腫瘤生長減緩,肝臟大轉移數(shù)量顯著減少,但組織學上沒有差異。接下來,用Rab27a的特異性小分子抑制劑Nexinhib20處理兩種動物模型(KPC、PDXs),來抑制EVs的分泌。結果顯示Nexinhib20處理后,KPC存活率顯著提高,PDXs腫瘤生長減緩。綜合表明Rab27a敲低會損害EVs介導的通訊,從而阻止癌癥的進展。



圖3 EVNet對腫瘤生長的影響
 

4. CSC分泌的 EVs是影響PDAC進展的原因
由于EVNet中最常見的通訊路徑是從CSC到NSCC,故特異性地去抑制CSC的EVs的通訊作用,從而研究其在生物學中的作用。首先從Rab27a敲低組和對照組中分別分離出CSC和NSCC細胞亞群,交叉混合后再原位移植到小鼠中,構建Rab27a敲低的CSC小鼠模型和NSCC小鼠模型。研究發(fā)現(xiàn),Rab27a敲低的CSC小鼠模型中,多四環(huán)素喂養(yǎng)的小鼠腫瘤生長緩慢,重量顯著降低;而Rab27a敲低的NSCC小鼠模型中,無顯著變化。表明敲低CSC中的Rab27a,抑制其通訊能力,才是影響腫瘤生長的原因。



圖4 CSC和NSCC通訊功能差異比較
 

5. CSC EVs具有獨特的蛋白質(zhì)組成并且富含agrin,促進腫瘤進展
為了找到CSC EVs如此特別的原因,研究人員采用labelfree蛋白質(zhì)組學對四種人PDAC細胞系的癌細胞亞群及其分泌的EVs分別進行檢測。通過一系列生物信息學比較分析細胞和外泌體,CSC和NSCC之間的蛋白表達及功能差異,發(fā)現(xiàn)CSC EVs和NSCC EVs的蛋白質(zhì)組成有非常大的差異,僅在CSC EVs中檢測到的大量蛋白質(zhì)與PDAC發(fā)生發(fā)展過程密切相關,例如軸突導向通路,其中agrin是最富集的蛋白質(zhì)之一。
在肝癌中,agrin通過與LRP-4受體結合激活YAP轉錄因子來促進肝癌發(fā)生。研究人員在胰腺癌細胞中也驗證了此通路的存在,證明了CSC EVs中的agrin促進YAP活化,促進癌細胞的增殖和存活率。



圖5 CSC和NSCC EVs蛋白質(zhì)表達及功能比較
 

6. Agrin是PDAC中CSC的潛在治療靶點
上文已經(jīng)證明了敲低Rab27a來抑制CSC中EVs的分泌可以抑制腫瘤生長,接下來,研究人員又試圖評估CSC EVs中特異性表達的agrin下調(diào)是否會對疾病進展產(chǎn)生影響。先從agrin敲低和對照組的細胞中分離出CSC和NSCC,再交叉混合移植到小鼠中,研究發(fā)現(xiàn)CSC中agrin下調(diào)會導致腫瘤生長減慢,腫瘤體積減小。在構建的agrin敲低的KPC模型(KPAC)中,與KPC小鼠相比,顯示出延遲的疾病進展,同時YAP表達顯著下調(diào)。以上實驗證明了agrin是胰腺癌治療干預的新靶點。



圖6 阻斷agrin的表達對疾病進展的影響
 

7. 循環(huán)agrin陽性EVs是疾病進展的預后標志物
最后,研究人員收集了44名胰腺癌患者的110例血液樣本,通過成像流式細胞術鑒定EV中agrin的表達,證明了cAGRN+EV的百分比與腫瘤負荷呈正比;其次發(fā)現(xiàn)了cAGRN+EVs和cCD133+EVs(來源于CSC)的百分比之間有顯著的相關性,進一步證明了cAGRN+EVs的來源;最重要的是,在沒有手術的患者中,cAGRN+EVs每增加1%,使疾病進展的風險增加2.94倍。
又通過受試者特征曲線(ROC)分析研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)agrin陽性EVs可作為未接受手術的患者疾病進展的特異性和敏感性的生物標志物,與cCD133+EVs組合會提高預測疾病進展的準確性。


圖7 疾病進程中循環(huán)agrin陽性EVs的變化
 

小編小結
腫瘤是不同癌細胞亞群組成的復雜實體。癌細胞亞群之間會通過EVs進行通訊交流,且這種通信對于癌細胞克服微環(huán)境變化和茁壯成長至關重要。本文的工作表明,胰腺癌細胞亞群通過富含agrin的CSC EVs建立了一個有組織的,具有可塑性的通信網(wǎng)絡EVNet。同時發(fā)現(xiàn)了agrin可作為胰腺癌治療干預的潛在新靶點,并在PDAC臨床樣本中,證實了cAGRN+EV是疾病進展的預后生物標志物,具有深遠的臨床意義。

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發(fā)布者:上海中科新生命生物科技有限公司
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