酶生物試劑試驗原理及注意事項

酶生物試劑實驗原理：

DNA重組技術(shù)的第一步是從不同來源的DNA上將待克隆的DNA片段特異性切下，同時在載體DNA分子（一般為質(zhì)粒DNA）上打開相應(yīng)的缺口，然后將兩者連接成重組DNA分子。這一特異性的切割過程常由特定的限制性核酸內(nèi)切酶來完成。

目前在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)有600多種限制性核酸內(nèi)切酶，根據(jù)其性質(zhì)的不同可分為三大類，分別為I、II和III類：I類酶識別部位和切點不同，切斷部位不定；III類酶的識別部位和切點不同，但切斷特定部位；II類酶切斷識別部位或其附近的特定部位，酶切后的雙鏈DNA的末端是粘性末端，某些限制酶產(chǎn)生平末端。因此，應(yīng)用于基因工程研究用的限制酶，一般全是II類酶，現(xiàn)在市場上銷售的酶都屬于II類酶。

酶生物試劑實驗注意事項：

反應(yīng)溫度：常規(guī)酶切反應(yīng)在37℃進(jìn)行，但有些酶的最佳反應(yīng)溫度并不是此溫度，如SmaI，最適反應(yīng)溫度為30℃，故最好根據(jù)所選用的酶來確定反應(yīng)溫度。當(dāng)采用聯(lián)合酶切進(jìn)行實驗時，尤其要注意選擇的反應(yīng)溫度是否都滿足兩者的要求，如果有一個酶的最適溫度不符，建議分步酶切。

緩沖體系：按鹽離子濃度可將緩沖溶液分為三類：高鹽、中鹽和低鹽。緩沖液配制為10×母液，酶切時稀釋10倍。常規(guī)酶切中均選用最佳緩沖液進(jìn)行酶切反應(yīng)，但聯(lián)合酶切時，根據(jù)廠商提供的聯(lián)合酶切緩沖液選擇表選擇緩沖液或采用萬能緩沖液。

反應(yīng)時間：常規(guī)酶切反應(yīng)時間為1.5 小時，但可根據(jù)酶切對象和酶的用量將保溫時間延長2～3 小時，有時甚至可以過夜。一般來說，在DNA 量固定的前提下，長時間酶切所需的酶量可適當(dāng)減少，所以在大劑量酶切DNA 時，可以考慮酶切過夜。

加入酶量：實驗中常常出現(xiàn)酶量加入過多酶切效果反差的現(xiàn)象，這主要是酶的貯存液中含有50％的甘油，但酶量加入過多，超過酶反應(yīng)體系的10％時，過多的甘油抑制了限制性內(nèi)切酶活性。因此，在酶切反應(yīng)時，酶量的加入原則：不超過反應(yīng)總體積的10％，在能切開的條件下加入越少越好（可減少酶的Star 活性）。

DNA 純度：DNA樣品中常含有蛋白含量過高、有機(jī)溶劑（苯酚或氯仿）殘留、高濃度的RNA 等雜質(zhì)影響酶切；DNA 濃度過高會導(dǎo)致酶切失敗，一般DNA 的質(zhì)量濃度在1μg/μl 體系中能取得好的酶切效果。當(dāng)發(fā)生不明原因的酶切失敗時，常用的解決方法是采用稀釋酶切，即將酶切體系放大，將雜質(zhì)相對濃度稀釋，這樣不需增加酶量就能取得較好的酶切效果。