國(guó)自然沖刺2：蛋白翻譯后修飾的基金申請(qǐng)解析與研究注意點(diǎn)

瀏覽次數(shù)：4357　發(fā)布日期：2019-3-6　

每年三月初，都是科研界的“高考”倒計(jì)時(shí)，因?yàn)榫嚯x國(guó)自然基金申請(qǐng)的截止日期已不到半月�？v觀歷年國(guó)自然申請(qǐng)情況，蛋白的翻譯后修飾都是申請(qǐng)中重大研究方向之一。2018年國(guó)自然統(tǒng)計(jì)表明，磷酸化、泛素化、乙�；刃揎椀南嚓P(guān)基金項(xiàng)目，總研究資助金額超過(guò)2億。

繼上周的腸道微生物研究方案解析后（國(guó)自然沖刺：打通菌群多樣性與功能的研究策略），本周我們?cè)僮ゾo時(shí)間為各位老師分享一下國(guó)自然中各類修飾的趨勢(shì)分析及組學(xué)研究的注意事項(xiàng)，以期為各位老師提供幫助。下面我們主要關(guān)注三種最常規(guī)研究的修飾類型——磷酸化修飾、泛素化修飾和乙�；揎�。

表現(xiàn)穩(wěn)定：磷酸化——全能調(diào)控之王

磷酸化是修飾中的全能調(diào)控之王，其研究最早，且分布廣，修飾量最多。在真核細(xì)胞中，約1/3的蛋白隨時(shí)都可以被磷酸化，幾乎參與所有的生理、病理過(guò)程。因此，磷酸化修飾是所有修飾中最被廣泛認(rèn)知和重點(diǎn)研究的。

▲ 磷酸化修飾在歷年國(guó)自然基金中的申請(qǐng)情況

綜上這些特點(diǎn)，在國(guó)自然基金申請(qǐng)中，與磷酸化、激酶相關(guān)的研究歷年所獲的資助項(xiàng)目數(shù)目均較多、且金額較高。然而，其成熟的研究基礎(chǔ)也使得其每年的基金資助趨勢(shì)穩(wěn)定平緩。2018年的基金統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，與磷酸化相關(guān)的項(xiàng)目數(shù)有105個(gè)，資助金額4768萬(wàn)，而與激酶相關(guān)的項(xiàng)目數(shù)140個(gè)，資助金額高達(dá)6414.9萬(wàn)，其中重點(diǎn)項(xiàng)目有2個(gè)。因此，磷酸化可以說(shuō)是修飾的基金申請(qǐng)中一個(gè)表現(xiàn)非常穩(wěn)定的方向。

圖1.國(guó)自然基金項(xiàng)目統(tǒng)計(jì)-磷酸化

▲ 磷酸化修飾組學(xué)研究方案的技術(shù)注意點(diǎn)：

● 磷酸化修飾肽段富集方法如何選擇？

由于發(fā)生磷酸化修飾的氨基酸有三種--絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸，故根據(jù)研究目的的不同，磷酸化修飾肽段的富集方法也不同。目前，比較成熟的磷酸化富集方法主要有：金屬螯合物富集（如TiO2、IMAC富集）和抗體富集兩類。

對(duì)于三種氨基酸位點(diǎn)上的修飾均關(guān)注的老師來(lái)說(shuō)，金屬螯合物富集是最常用的富集介質(zhì)。其富集效率較高，通常可以達(dá)到90%以上，其中一些商品化的IMAC試劑盒具備很理想的富集穩(wěn)定性。

而對(duì)于重點(diǎn)關(guān)注酪氨酸磷酸化修飾變化的老師來(lái)說(shuō)（比如說(shuō)不少關(guān)注腫瘤領(lǐng)域中受體酪氨酸激酶研究的方向），使用TiO2、IMAC則無(wú)法滿足要求了，這是由于酪氨酸磷酸化的修飾比例非常低，僅占所有蛋白質(zhì)磷酸化比例的1%。因此，針對(duì)這類分析，往往采用酪氨酸特異性基序的抗體進(jìn)行富集，才能獲得最佳結(jié)果（中科新生命（APT）采用抗體界的金標(biāo)準(zhǔn)--CST的抗體進(jìn)行酪氨酸磷酸化的富集）。

● 對(duì)于后續(xù)結(jié)果驗(yàn)證或者靶向檢測(cè)的研究目的，如果沒(méi)有修飾位點(diǎn)的抗體該怎么辦？

基于質(zhì)譜的PRM技術(shù)是修飾組后續(xù)驗(yàn)證或目標(biāo)位點(diǎn)靶向檢測(cè)的最佳選擇之一。PRM驗(yàn)證全稱是Parallel Reaction Monitoring,其是基于高分辨率質(zhì)譜發(fā)展的靶向定量技術(shù)。由于其只針對(duì)特定目標(biāo)信號(hào)進(jìn)行掃描，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白、修飾位點(diǎn)的精準(zhǔn)定量，其應(yīng)用目的類似于Western blot。

PRM已逐漸被業(yè)內(nèi)廣泛認(rèn)可和關(guān)注，Nature、PNAS等高水平研究中已有多篇研究應(yīng)用。此外，PRM可同時(shí)對(duì)多個(gè)蛋白、修飾位點(diǎn)進(jìn)行定量，相比傳統(tǒng)的WB,不僅更準(zhǔn)確、精細(xì)而且更高效。目前，中科新生命已推出磷酸化修飾組+PRM驗(yàn)證一站式服務(wù)，幫助老師快速解決驗(yàn)證之憂。

● 磷酸化修飾組對(duì)樣本量的要求如何？

勢(shì)頭正猛：泛素化——蛋白表達(dá)調(diào)控研究的新角度

泛素化是所有修飾中最為特別的一類修飾，由于發(fā)生泛素化修飾的蛋白往往會(huì)進(jìn)一步通過(guò)蛋白酶體發(fā)生降解（也有一部分會(huì)發(fā)揮腳手架的作用促進(jìn)蛋白復(fù)合體形成等），因此，蛋白表達(dá)水平變化往往是泛素化修飾的重要關(guān)注點(diǎn)。泛素化修飾與轉(zhuǎn)錄、蛋白水平研究同樣重要的，都是調(diào)控蛋白表達(dá)水平的重要機(jī)制之一，但卻往往被研究人員所忽略，其具備相對(duì)較高的研究創(chuàng)新性。

▲ 泛素化修飾在歷年國(guó)自然基金中的申請(qǐng)情況

從歷年的基金申請(qǐng)情況看，泛素化修飾所申請(qǐng)項(xiàng)目數(shù)與金額自2013年后每年均呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，而且2017年-2018年的增長(zhǎng)速度為歷年最快。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，2018年泛素化研究的資助項(xiàng)目達(dá)137個(gè)，資助金額共6680.45萬(wàn)，其中重點(diǎn)項(xiàng)目有5個(gè)。

由此可見(jiàn)，泛素化相關(guān)基金無(wú)論是申請(qǐng)項(xiàng)目數(shù)還是金額數(shù)均在向磷酸化逼近，甚至從重點(diǎn)項(xiàng)目數(shù)看，18年泛素化的項(xiàng)目數(shù)已然超過(guò)了磷酸化。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)表明，泛素化研究資助項(xiàng)目在醫(yī)學(xué)部中一共98項(xiàng)，總資助金額高達(dá)4700萬(wàn)元。由此可見(jiàn)，泛素化的相關(guān)研究正是科研界的“當(dāng)紅小生”，基金申請(qǐng)的一大熱點(diǎn)。

圖2.國(guó)自然基金項(xiàng)目統(tǒng)計(jì)-泛素化

除基金之外，近幾年，泛素化更是頻頻出現(xiàn)在各大CNS頂級(jí)雜志上，成為CNS雜志綜述討論的熱點(diǎn)話題，從各種生理過(guò)程、到腫瘤、衰老等疾病、再到藥物開(kāi)發(fā)。可見(jiàn)，其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要作用、巨大潛力越來(lái)越得到重視，并有望成為繼磷酸化之后的第二大明星修飾類型。

中科新生命

▲ 泛素化修飾組研究方案的技術(shù)注意點(diǎn)：

● 泛素化修飾肽段富集的選擇？

目前，泛素化修飾肽段的富集還是采用基于賴氨素修飾基序抗體（K-GG）進(jìn)行富集（同樣，中科新生命是采用來(lái)自CST公司的抗體進(jìn)行富集）。

● 泛素化修飾組的結(jié)果如何解讀？后續(xù)驗(yàn)證有什么注意點(diǎn)？

由于泛素化修飾的蛋白很可能涉及后續(xù)的蛋白降解，因此各位老師在拿到泛素化組的數(shù)據(jù)時(shí)，如果發(fā)現(xiàn)結(jié)果中呈現(xiàn)出泛素化修飾的表達(dá)減少，不要認(rèn)為一定是泛素化修飾水平降低了！其既有可能是修飾水平降低了也有可能是修飾水平增加了，這是泛素化修飾與其他修飾的結(jié)果解讀非常不同的地方。因?yàn)榉核鼗揎椩黾涌芍苯訉?dǎo)致蛋白降解，所以蛋白若是發(fā)生了泛素-蛋白酶體降解，其修飾量也是隨著蛋白降解而降低的。因此，對(duì)于進(jìn)行細(xì)胞水平研究的老師而言，我們建議需要用MG132預(yù)先處理細(xì)胞，抑制泛素酶體的降解過(guò)程。對(duì)于泛素化修飾的后續(xù)驗(yàn)證，不僅要驗(yàn)證修飾水平的變化，還要再進(jìn)行蛋白水平的驗(yàn)證分析。

● 泛素化修飾組對(duì)樣本量的要求如何？

推薦：常規(guī)動(dòng)物組織樣本120mg-2g；常規(guī)植物組織樣本500mg-2g；細(xì)胞樣本1-5×10^8個(gè)細(xì)胞

另辟蹊徑：乙�；揎�----代謝表現(xiàn)背后的調(diào)控機(jī)制

相對(duì)于磷酸化、泛素化而言，乙�；芯扛鼘�(duì)關(guān)注于其對(duì)組蛋白的表觀調(diào)控，而非組蛋白上的乙酰化修飾則相對(duì)較少。尤其是乙�；瘜�(duì)代謝過(guò)程的廣泛調(diào)控作用，更是近些年才被認(rèn)知的開(kāi)創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)。

▲ 乙�；揎椩跉v年國(guó)自然基金中的申請(qǐng)情況

從歷年的基金申請(qǐng)情況看，乙�；揎棻憩F(xiàn)絲毫不落后，其相關(guān)研究所申請(qǐng)到的項(xiàng)目數(shù)、金額均呈現(xiàn)逐年增加的趨勢(shì)，而且，在近兩年（2016年-2018年）的增加速度最快。2018年，乙�；芯康馁Y助項(xiàng)目有111個(gè)，資助金額共5426萬(wàn)，重點(diǎn)項(xiàng)目2個(gè)。其中，醫(yī)學(xué)部的乙�；芯抠Y助項(xiàng)目占48項(xiàng)，共3800萬(wàn)元資助。

圖3.國(guó)自然基金項(xiàng)目統(tǒng)計(jì)-乙�；�

實(shí)際上，乙�；难芯恳延�50年，除了發(fā)生于組蛋白，還有有大量的乙�；揎椀鞍状嬖谟诩�(xì)胞漿、線粒體等中，其對(duì)于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、自噬等生物功能有廣泛的調(diào)控作用。2009年，SCIENCE同時(shí)發(fā)表兩篇研究，把乙�；芯繋氲揭粋€(gè)新高度。其中一篇SCIENCE報(bào)道，在肝臟中發(fā)現(xiàn)了超過(guò)1000個(gè)乙�；鞍踪|(zhì)，且代謝酶上普遍發(fā)生這樣的修飾，至此，乙酰化調(diào)控代謝成為了編入教科書(shū)級(jí)的發(fā)現(xiàn)，代謝表型背后的調(diào)控機(jī)制--乙酰化，成為了代謝調(diào)控研究的新領(lǐng)域。這幾年的nature reviews上，也是頻頻刊登“乙�；{(diào)控代謝”的熱點(diǎn)綜述。

nature reviews

從組學(xué)的研究來(lái)看，乙酰化調(diào)控代謝是從一個(gè)非常具有新穎性的切入角度，這個(gè)角度使得對(duì)乙酰化功能的探索不僅僅局限于組蛋白上。因此，修飾組配合代謝組進(jìn)行研究，是打通機(jī)制與表型的研究策略，是一個(gè)更為完整、創(chuàng)新的國(guó)自然基金研究方案。

▲ 乙�；揎椊M研究方案的技術(shù)注意點(diǎn)：

● 乙�；揎楇亩胃患绾芜x擇？對(duì)樣本量要求如何？

乙酰化修飾肽段富集主要采用賴氨酸乙�；蚩贵w進(jìn)行富集（同樣，中科新生命使用CST公司的修飾抗體）。

● 若要進(jìn)行乙�；M+代謝組的聯(lián)合分析，對(duì)樣本有何要求？

對(duì)于聯(lián)合而言，保證兩個(gè)組學(xué)樣本間的一致性是關(guān)鍵。因此，乙�；c代謝聯(lián)合，我們推薦兩個(gè)組學(xué)的樣本來(lái)源均一致。如果有老師想要進(jìn)一步利用相關(guān)性分析進(jìn)行深入數(shù)據(jù)挖掘，兩個(gè)組學(xué)之間的樣本重復(fù)數(shù)目也要保持一致。

● 乙酰化修飾組對(duì)樣本量的要求如何？

推薦：常規(guī)動(dòng)物組織樣本120mg-2g；常規(guī)植物組織樣本500mg-2g；細(xì)胞樣本1-5×10^8個(gè)細(xì)胞

總結(jié)

縱觀歷年國(guó)自然申請(qǐng)情況，修飾都是申請(qǐng)中重大研究方向之一。到2018年國(guó)自然，磷酸化、泛素化、乙酰化，每一類修飾類型的項(xiàng)目資助金額均超過(guò)5000萬(wàn)，修飾方向的總研究資助金額超2億。

如今，隨著研究技術(shù)的發(fā)展，質(zhì)譜作為研究翻譯后修飾的最重要技術(shù)之一，越來(lái)越被廣泛的應(yīng)用于修飾的研究之中，也越來(lái)越能夠與傳統(tǒng)的分子生物學(xué)契合，助力高層次的研究。