細(xì)胞鈣離子濃度比色法定量檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明

細(xì)胞鈣離子濃度比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

細(xì)胞鈣離子濃度比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)鄰甲酚酞絡(luò)合酮，在堿性條件下與鈣離子反應(yīng)產(chǎn)生紫藍(lán)色復(fù)合物，在分光光度儀下通過(guò)吸光峰值的變化，即采用比色法來(lái)測(cè)定樣品中總鈣離子濃度的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞（動(dòng)物、人體等）裂解萃取樣品中總鈣離子的濃度檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，檢測(cè)敏感。

技術(shù)背景

鈣是人體中的一種重要電介質(zhì)和礦物質(zhì)，占1150克。其中99％的鈣以氟磷灰石鈣（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細(xì)胞內(nèi)。鈣具有兩種主要形式：一種是非彌散型蛋白結(jié)合鈣，其構(gòu)成約40％至50％的血清中的總鈣含量；另一種為彌散型游離鈣，其進(jìn)一步分成具有活性的復(fù)合鈣（complexed calcium）和離子鈣（ionized calcium）。鈣對(duì)神經(jīng)肌肉興奮性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運(yùn)輸、釋放神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)、信使傳導(dǎo)等方面起著重要作用。鈣的檢測(cè)包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等技術(shù)，但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾，或者受限于儀器的特殊的要求。鄰甲酚酞絡(luò)合酮（o-cresolphthalein complexone；CPC）比色法是一種穩(wěn)定、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的鈣檢測(cè)技術(shù)。鈣與鄰甲酚酞絡(luò)合酮，在堿性條件下反應(yīng)產(chǎn)生紫藍(lán)色復(fù)合物，在分光光度儀下通過(guò)吸光峰值的變化（波長(zhǎng)570nm），來(lái)定量測(cè)定細(xì)胞鈣的總濃度。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

OH^-

  Ca^＋＋  +  o-cresolphthalein complexone   →    violet complex dye

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）     120毫升

裂解液（Reagent B）  5毫升

緩沖液（Reagent C） 20毫升

反應(yīng)液（Reagent D）     2.5毫升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）    500微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)     1份

保存方式

保存在4℃冰箱里；緩沖液（Reagent C）、反應(yīng)液（Reagent D）和標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于標(biāo)準(zhǔn)樣品配制和樣品保存的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于貼壁細(xì)胞脫離

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備

比色皿：用于反應(yīng)的容器

分光光度儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

• 樣品準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1 X 10⁶細(xì)胞）
• 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面
• 小心抽去清理液
• 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始）
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入200微升裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

• 測(cè)定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好上述制備的待測(cè)樣品，置于冰槽里備用
• 設(shè)定好分光光度儀：波長(zhǎng)570nm，并置零 
• 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管
• 分別加入100微升緩沖液（Reagent C）到2至5號(hào)管
• 移取200微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到1號(hào)管，混勻
• 小心移取100微升1號(hào)管的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到2號(hào)管，混勻
• 小心移取100微升2號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到3號(hào)管，混勻
• 小心移取100微升3號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到4號(hào)管，混勻
• 將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見(jiàn)下表

三、比色測(cè)定

• 移取800微升緩沖液（Reagent C）到新的1毫升比色皿
• 加入100微升反應(yīng)液（Reagent D）
• （選擇步驟）放進(jìn)分光光度儀，置零
• （選擇步驟）取出比色皿
• 加入100微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液或待測(cè)樣品 
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 室溫下孵育5分鐘，避免光照
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)（OD）
• 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光單位（OD）；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)鈣濃度（毫摩爾/升）
• 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)鈣濃度（毫摩爾/升）
• 計(jì)算樣品實(shí)際鈣濃度（毫摩爾/升）

【根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)鈣濃度（毫摩爾/升） X 樣品稀釋倍數(shù)】＝毫摩爾/升

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為25次操作，包括標(biāo)準(zhǔn)液
• 操作時(shí)，須戴手套
• 避免使用EDTA等處理樣品
• 建議樣品保存在－70℃冰箱里
• 系統(tǒng)操作過(guò)程中，標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定只需1次
• 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行比色測(cè)定
• 如果樣本鈣離子過(guò)低，可以增加孵育時(shí)間至30分鐘
• 比色測(cè)定后，比色皿須清洗徹底
• 如果用戶沒(méi)有匹配的濾波器，可以使用570nm至600nm之間的任一波長(zhǎng)
• 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
• 檢測(cè)范圍在5微摩爾/升至0.5毫摩爾/升鈣濃度范圍：參考標(biāo)準(zhǔn)曲線如下 

• 如果用戶需要檢測(cè)1至4毫摩爾/升鈣濃度，請(qǐng)購(gòu)買相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液即可
• 本公司提供系列鈣生化檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感