人源化小鼠對hPD1 CTLA4雙特異性抗體的臨床前影像學(xué)評價(jià)

文獻(xiàn)信息
北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所，核醫(yī)學(xué)科，國家藥監(jiān)局放射性藥物研究與評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、貴州大學(xué)醫(yī)學(xué)院等團(tuán)隊(duì)合作的研究成果Preclinical imaging evaluation of a bispecific antibody targeting hPD1/CTLA4 using humanized mice（人源化小鼠對hPD1/ CTLA4雙特異性抗體的臨床前影像學(xué)評價(jià)）在學(xué)術(shù)期刊《Biomedicine & Pharmacotherapy》發(fā)表。平生公司的小動(dòng)物PET/CT（型號：Super Nova）產(chǎn)品在論文中提供了重要的腫瘤小鼠PET/CT圖像和定量分析。

該研究的通訊作者為北腫楊志主任，朱華研究員。第一作者為侯興國。

文獻(xiàn)背景
背景:缺乏一種有效的方法來篩選對PD1/CTLA4靶向癌癥治療的免疫治療挑戰(zhàn)有反應(yīng)的患者。免疫治療效果不能通過外周血分析、組織基因標(biāo)記或CT/MR值明確確定。在這里，作者使用放射性核素和成像技術(shù)在體內(nèi)研究PD1/CTLA4陽性細(xì)胞中的新型雙靶向抗體卡多尼利單抗(AK104)。

 方法:首先，人源化PD1/CTLA4小鼠在t細(xì)胞中表達(dá)hPD1/CTLA4。然后，在人源化小鼠中建立小鼠結(jié)腸癌MC38-hPD-L1細(xì)胞異種移植物。一種靶向PD1/CTLA4 (AK104)的雙特異性抗體用放射性核素碘同位素標(biāo)記。使用自主研發(fā)的雙特異性單克隆抗體(mAb)探針¹²⁴IAK104進(jìn)行免疫PET/CT成像，定位PD1+/CTLA4+腫瘤浸潤T細(xì)胞并監(jiān)測其在小鼠中的分布，以評估治療效果。
 結(jié)果:成功構(gòu)建的¹²⁴I-AK104雙抗體具有理想的放射化學(xué)特性、體外穩(wěn)定性和特異性。免疫PET結(jié)果顯示，¹²⁴I-AK104在人源化小鼠中表現(xiàn)出高特異性的強(qiáng)hPD1/CTLA4陽性反應(yīng)。¹²⁴I-AK104的高攝取不僅在腫瘤部位，而且在脾臟也被觀察到。與PD1-或CTLA-4 -靶向mAb成像相比，¹²⁴I-AK104成像在腫瘤部位具有出色的標(biāo)準(zhǔn)攝取值，并且具有更高的腫瘤與非腫瘤(T/NT)比率。
 結(jié)論:本研究結(jié)果證明了將¹²⁴I-AK104轉(zhuǎn)化為篩選免疫治療獲益患者的方法的潛力，并且通過人源化小鼠的免疫PET成像驗(yàn)證了該方法的有效性和可行性。

實(shí)驗(yàn)方法
動(dòng)物模型
C57BL/6-Pdcd1^tm1(PDCD1)Ctla4^tm1(CTLA4)/Bcgen-MC38-hPD-L1小鼠用于免疫PET成像和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。B-hPD1/hCTLA4小鼠的基因靶向策略:在B-hPD1/hCTLA4小鼠中，編碼lgV結(jié)構(gòu)域的小鼠Pdcd1基因外顯子2被人Pdcd1外顯子2取代。在B-hPD1/hCTLA4小鼠中，編碼細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的小鼠Ctla4基因外顯子2被人Ctla4外顯子2取代。在4-6周齡雌性B-hPD1/ hCTLA4小鼠中建立MC38-hPD-L1異種移植物(MC38細(xì)胞經(jīng)基因修飾表達(dá)人PD-L1，命名為MC38-hPD-L1)。簡單地說，在MC38-hPD-L1細(xì)胞中，小鼠Pdl1基因被人類PD-L1編碼序列所取代。插入外源啟動(dòng)子和人PD-L1編碼序列，替換部分小鼠外顯子3。插入破壞內(nèi)源性小鼠Pdl1基因，導(dǎo)致無功能轉(zhuǎn)錄。將PBS重懸的MC38-hPD-L1細(xì)胞以5×105細(xì)胞/0.1 mL的體積接種于B-hPD1/hCTLA4人源化小鼠右側(cè)皮下)。

 Micro-CT
正常KM小鼠和B-hPD1/hCTLA4-MC38-hPD-L1小鼠通過尾靜脈注射3.7 MBq的¹²⁴I-AK104/AK105/抗CTLA4 (n=3)。所有小鼠在注射放射性標(biāo)記抗體72小時(shí)前在其飲用水中給予0.5%碘化鉀溶液，以阻斷甲狀腺的生理攝取。然后在注射后2、24、96和192 h (p.i)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行10 min靜態(tài)PET掃描。使用小動(dòng)物PET/CT掃描儀(Super Nova PET/CT, 平生醫(yī)療科技有限公司)，通過Avatar 3重建PET圖像，并通過繪制這些器官的ROI來計(jì)算感興趣區(qū)域(ROI)衍生的標(biāo)準(zhǔn)攝取值(SUV)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果
在不同的時(shí)間點(diǎn)(2、24、96和192 h)，通過勾畫免疫圖像PET的ROI，獲得B-hPD1/hCTLA4-MC38-hPD-L1小鼠幾個(gè)器官的SUVmax數(shù)據(jù)(圖4A和B)。值得注意的是，¹²⁴I-AK104的腫瘤攝取在注射后24小時(shí)達(dá)到峰值，然后下降(圖4B)。成像小鼠生物分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果與成像結(jié)果一致(圖4C)。作者在小鼠成像后進(jìn)行了生物分布實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這三種探針主要分布在脾臟，這主要是因?yàn)門細(xì)胞是由脾臟產(chǎn)生的。除脾臟外，AK104在腫瘤部位大量富集。雖然CTLA4單克隆抗體在腫瘤部位攝取明顯，但在非腫瘤部位也有較高的攝取。在非腫瘤部位未發(fā)現(xiàn)AK105的顯著富集。此外，¹²⁴I-AK104組的T/NT比率高于其他組(圖4D)。

圖4 ¹²⁴I-AK104、¹²⁴I-AK105和¹²⁴I-anti-CTLA4治療MC38-hPD-L1荷瘤小鼠的免疫PET成像分析(A)三組小鼠在2,24,96和192 h的免疫PET/CT圖像。(B)不同組小鼠在2,24,96和192 h的解剖器官SUVmax。(C)尾靜脈注射后192 h B-hPD-1/hCTLA4-MC38-hPD-L1小鼠體內(nèi)¹²⁴IAK104、¹²⁴I-AK105和¹²⁴I-anti-CTLA4的生物分布。(D)尾靜脈注射192 h后T/NT。

文獻(xiàn)結(jié)論
總之，作者的研究通過成像方法證明了PD1/CTLA4-陽性浸潤T細(xì)胞在人源化小鼠腫瘤部位的存在。作者的研究結(jié)果表明，這種方法可以用于識別可能受益于免疫治療的患者，并監(jiān)測治療的有效性。此外，作者發(fā)現(xiàn)¹²⁴I-AK104的攝取與PD1/CTLA4的表達(dá)水平相關(guān)，這一點(diǎn)通過人源化小鼠和PD1/CTLA4 IHC的SUVmax分析得到了證實(shí)。本研究的方法和結(jié)論可為免疫治療反應(yīng)監(jiān)測的臨床前研究提供依據(jù)。

使用設(shè)備

Super Nova^® Micro PET/CT（III 代外觀圖）