IHC實驗切片染色后背景太深現(xiàn)象分析

免疫組織化學(xué)（IHC）是利用抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)來檢測和定位組織和細胞中的某些化學(xué)物質(zhì)的一門技術(shù)。全片著色是指整個切片全都染上了顏色，著色的強度可深可淺，總之，分不清那些組織陽性那些組織是陰性。切片染色后背景太深，出現(xiàn)特異性與非特異性著色。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因分析有：
 

1、抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對其工作濃度進行測試，使每一抗體個體化，找到適合自己實驗室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應(yīng)如此，不能只簡單的按說明書進行染色。

2、抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，最好隨身佩帶報時表或報時鐘，及時提醒，避免因遺忘而造成時間延長。現(xiàn)在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時間不是傳統(tǒng)的1小時，而是30分鐘，因此，要根據(jù)染色結(jié)果進行調(diào)整。

3、DAB變質(zhì)和顯色時間太長：DAB最好現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進行過濾后再用。配制好的DAB不應(yīng)存放時間太長，因為在沒有酶的情況下，過氧化氫也會游離出氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色最好在顯微鏡下監(jiān)控，達到理想的染色程度時立即終止反應(yīng)。不過當(dāng)染色片太多時或用染色機時，這樣做似乎不現(xiàn)實，但至少應(yīng)對一些新的或少用的抗體顯色時進行監(jiān)控，避免顯色時間過長。

4、組織變干：修復(fù)液溢出后未及時補充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認(rèn)真仔細，采用DAKO筆或PAPPen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。

5、切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時間太長（大于24小時）：原因上不清楚，但現(xiàn)象存在。有的實驗室喜歡前一天將切片脫蠟至修復(fù)，第二天加抗體進行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在4?C冰箱過夜，對結(jié)果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會出現(xiàn)背景著色，因此，不可存放時間太長。

6、一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麼不顯色要麼背景著色。用新買的抗體時最好設(shè)立陽性對照和用使用過的抗體作比較。