Histopaque® 密度梯度介質(zhì)故障排除指南
我們的技術(shù)支持科學(xué)家基于實(shí)際解決客戶問(wèn)題時(shí)觀察到的現(xiàn)象及總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)，編譯了以下關(guān)于在細(xì)胞分離技術(shù)中使用 Histopaque 和 ACCUSPIN™ 的故障排除建議。本指南針對(duì)使用 Histopaque 時(shí)觀察到的最常見(jiàn)錯(cuò)誤來(lái)源提出解決方案，但這并不代表本指南是全面無(wú)遺的。
使用 Histopaque/ACCUSPIN 時(shí)觀察到的典型問(wèn)題- 從人體血液中分離單核或多形核細(xì)胞的困難
- 從大鼠或小鼠血液中分離單核或多形核細(xì)胞的困難
- 低恢復(fù)
- 分離細(xì)胞中的紅細(xì)胞、血小板或中性粒細(xì)胞污染
| 原因 | 溶液 |
|---|---|
| 分離前 >24 小時(shí)抽血 | 分離前 2-6 小時(shí)抽血。抽血 >24 小時(shí)將更難分離，回收率和存活率將更低。 |
| 由于沒(méi)有抗凝劑，血液已凝固 | 建議使用帶預(yù)裝抗凝劑的真空管。不建議使用注射器（不含抗凝劑）。 |
| 由于混合不完全，血液已經(jīng)凝固 | 確保抽完血后真空管與抗凝劑充分混合。 |
| 使用的抗凝劑不適用于 Histopaque 分離應(yīng)用 | 以下抗凝劑適用于 Histopaque： • 每毫升全血含有 15-30 單位肝素 • 每毫升全血中含有 1.25-1.75 mg EDTA ACA-A（酸性檸檬酸葡萄糖配方 A）可用作抗凝劑.分離后，產(chǎn)生的單核細(xì)胞帶將比其他抗凝劑更寬。這是正常的，細(xì)胞可以使用。 |
| 抽血后血液樣本溫度過(guò)高，分離嘗試太快 | 紅細(xì)胞污染可能是因?yàn)檠翰辉谑覝叵露a(chǎn)生的。 抽血后，應(yīng)讓血液在室溫下至少冷卻 30-45 min。如果在取材后立即使用，采集的單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量會(huì)很低。當(dāng)血液和 Histopaque 都在 18-20°C 時(shí)，分離程序是最佳的，可接受的溫度范圍為 18-26°C。 |
| 用高鹽濃度 PBS 稀釋血樣 | 與 Histopaque 一起使用的歷史細(xì)胞分離技術(shù)包括用 PBS (1：1) 稀釋血液。隨后，我們發(fā)現(xiàn)并非所有 PBS 制劑都適合與 Histopaque 一起使用。 含有 150 mm 磷酸鹽緩沖液和 150 mm 氯化鈉的溶液是鹽濃度太高而不能與 Histopaque 一起使用的 PBS 溶液.接近 10 mm 磷酸鹽的 PBS 摩爾濃度更適合與 Histopaque 一起使用。當(dāng)用合適的細(xì)胞培養(yǎng)基代替高鹽濃度的 PBS 時(shí)，細(xì)胞活力將保持較高水平。 |
| 供體血液生理學(xué)的差異（當(dāng)單個(gè)樣本的恢復(fù)較差時(shí)） | 高血脂、類風(fēng)濕因子、貧血和藥物治療都可能是導(dǎo)致特定供者血液分離不良的原因。 如果血漿不清澈，則表明血脂水平過(guò)高. |
| 小動(dòng)物樣品被其他液體或固體污染 | 由于在采集的血液中存在毛發(fā)和其他體液，因此從非針?lè)绞讲裳ɡ缤ㄟ^(guò)尾部取樣）獲得的血液通常不可用。這通常引發(fā)凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生凝血。 建議處死動(dòng)物，通過(guò)主動(dòng)脈或腔靜脈或其他大血管獲取血液。或者，可以使用兒科真空管抽血。 |
| 高水平白細(xì)胞樣本中白細(xì)胞的閉塞 | 當(dāng)紅細(xì)胞與多聚蔗糖接觸時(shí)可形成聚集體，導(dǎo)致白細(xì)胞閉塞。一旦被困在這些聚集體中，白細(xì)胞就會(huì)移動(dòng)到離心管的底部。 對(duì)于常規(guī)血液標(biāo)本，未稀釋血液的回收率通常會(huì)更高。但應(yīng)稀釋骨髓、臍帶血和白細(xì)胞計(jì)數(shù)異常增高的供者樣本，以縮小紅細(xì)胞聚集體的體積，提高白細(xì)胞的回收率。 |
| 血液稀釋不當(dāng)或用污染的 PBS 或培養(yǎng)基稀釋 | 在 Histopaque® 上樣前稀釋血液時(shí)，緩沖液或培養(yǎng)基配方有可能與 Histopaque 不相容，或者 PBS 或細(xì)胞培養(yǎng)基被污染。 如果血液已經(jīng)被稀釋且收率很差，則重復(fù)實(shí)驗(yàn)，不進(jìn)行樣品稀釋。 |
| 使用含有 FBS 或其他載體蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋 | 當(dāng)稀釋樣品用于 Histopaque 時(shí)，不含 FBS 的細(xì)胞培養(yǎng)基可替代 PBS。如果用含有 FBS 的細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋血液，回收的細(xì)胞數(shù)會(huì)更低。 在分離細(xì)胞并至少洗滌一次以除去 Histopaque 后，可將 FBS 加入到培養(yǎng)基中用于隨后的洗滌或儲(chǔ)存。第一次洗滌后，在洗滌介質(zhì)中加入 FBS 等蛋白質(zhì)，將進(jìn)一步保護(hù)細(xì)胞免受損傷。 |
| 用 Histopaque 從白膜層中分離細(xì)胞 | 在合適的抗凝劑中收集血液并離心制備白膜層。紅細(xì)胞會(huì)沉淀到試管的底部。緊靠紅細(xì)胞層上方將是一個(gè)灰色層。這個(gè)灰色層是白膜層，代表了血液中所有的白細(xì)胞。在灰色層上面的是血漿。 用新鮮血液制備的白膜層適合使用 Histopaque 進(jìn)行分離。如果細(xì)胞是幾天齡的，例如，如果白膜層是從捐獻(xiàn)的血液?jiǎn)挝猾@得的，細(xì)胞可能無(wú)法提供可接受的收率。 在加載到 Histopaque 梯度之前，必須將白膜層至少稀釋 1:2 或 1:4。 |
| 使用 ACCUSPIN™ 試管從白膜層分離細(xì)胞 | 白膜層制劑不能用于 ACCUSPIN 管。ACCUSPIN 試管需要一定數(shù)量的紅細(xì)胞才能正常工作，而白膜層缺乏足夠用于 ACCUSPIN 試管的紅細(xì)胞。 |
Histopaque/ACCUSPIN 故障排除提示
| 原因 | 溶液 |
|---|---|
| Histopaque的細(xì)菌污染 | Histopaque 是作為無(wú)菌溶液制造的。沒(méi)有防腐劑，以減少污染的機(jī)會(huì)。如果懷疑有污染，請(qǐng)使用新鮮的 Histopaque 瓶。 |
| Histopaque 溫度太低 | 如果使用冷的 Histopaque 或填充的 ACCUSPIN 試管，收率通常很低，并可觀察到細(xì)胞結(jié)塊。紅細(xì)胞污染也可能是因?yàn)?Histopaque 不在室溫下產(chǎn)生的。 執(zhí)行規(guī)程時(shí)溫度非常重要。在 2-8°C 條件下儲(chǔ)存的 100 mL 或 500 mL 瓶裝 Histopaque 可能需要幾個(gè)小時(shí)才能達(dá)到 18-20°C。在計(jì)劃使用 Histopaque 時(shí)，我們建議前一天從冰箱中取出 Histopaque，將瓶子放在長(zhǎng)凳上靜置過(guò)夜。這可確保溶液處于室溫并可供使用。 也可選擇將適量的 Histopaque 轉(zhuǎn)移到每個(gè)離心機(jī)或 ACCUSPIN 管中，取較小體積適應(yīng)室溫。 收集細(xì)胞帶并進(jìn)行第一次洗滌后，可在 4 °C 下進(jìn)行余下的洗滌步驟。 |
技術(shù)故障排除提示
| 原因 | 溶液 |
|---|---|
| 在 Histopaque 上分層血液后延遲處理樣品 | 當(dāng)將血液分層到用于單核細(xì)胞的梯度上時(shí)，不需要精確分層。如果在血液和 Histopaque 之間發(fā)生一點(diǎn)混合，細(xì)胞帶仍然會(huì)正常形成。 一旦血液分層，務(wù)必立即將離心管放入離心機(jī)。如果時(shí)間太長(zhǎng)，整層的 Histopaque 會(huì)被紅血球染成紅色。在一定的“形成液滴”的數(shù)量下，這可能會(huì)降低單核細(xì)胞的回收率。應(yīng)限制一次處理的試管數(shù)量，以減少這種細(xì)胞擴(kuò)散。 |
| 分離中性粒細(xì)胞時(shí) Histopaque® 1077 和 Histopaque 1119 的分層不當(dāng) | 當(dāng)同時(shí)使用 Histopaque 1077 和 Histopaque 1119 分離中性粒細(xì)胞時(shí)，必須謹(jǐn)慎操作來(lái)防止溶液界面的混合。 使用紋技術(shù)檢查界面的完整性。拿著試管對(duì)光觀察時(shí)，任何兩層之間界面處的旋渦或混合都應(yīng)該是明顯的。如果界面處理得當(dāng)，應(yīng)該有一條清晰的分界線。 如果無(wú)清晰的分界線或界面處存在渦流，則丟棄管子重做。 梯度形成后立即使用也很重要。1077 和 1119 之間沒(méi)有化學(xué)差異；這兩種解決方案具有相同的組分，并將隨著時(shí)間開始一起擴(kuò)散。當(dāng)這種情況發(fā)生時(shí)，恢復(fù)將很差或根本不存在。 |
| 使用的粉末對(duì)有粉手套的污染。 | 不應(yīng)使用有粉手套。手套粉末會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞聚集。僅限使用無(wú)粉手套。 |
| 使用的離心力不正確 | 應(yīng)檢查離心機(jī)以確保正確校準(zhǔn)。過(guò)強(qiáng)的力（較高的離心速度）會(huì)降低收率。 |
| 使用前將 Histopaque 高壓滅菌 | Histopaque 不能通過(guò)高壓法滅菌；高壓滅菌會(huì)使溶液中的多聚蔗糖焦糖化，使其變成棕色�？赏ㄟ^(guò) 0.22 微米過(guò)濾器無(wú)菌過(guò)濾 Histopaque。 |
| 分離后細(xì)胞內(nèi)的血小板或中性粒細(xì)胞污染 | 血小板污染或中性粒細(xì)胞污染一般是因?yàn)椴杉?xì)胞帶時(shí)采集過(guò)多血漿或 Histopaque 1077 或 1083 而產(chǎn)生的。減少收集血漿或 Histopaque 的量。 |
| 用于清洗細(xì)胞聚合體的容量過(guò)大 | 洗滌細(xì)胞聚合體通常會(huì)去除血小板。如果在細(xì)胞聚合體上留下大量的洗滌液，將導(dǎo)致細(xì)胞懸液中血小板增多。 在不干擾細(xì)胞聚合體的情況下，盡可能多地去除洗滌介質(zhì)。血小板在 1000× g 的離心力下作用 10 min 通常不會(huì)聚合。在建議的洗滌步驟的較低離心速度下，血小板應(yīng)保持懸浮在洗滌介質(zhì)或上清液中。 |
| 細(xì)胞聚合體不形成單細(xì)胞懸液 | 重新懸浮細(xì)胞聚合體時(shí)，只需使用少量洗滌液。在 15 mL 或 50 mL 離心管中進(jìn)行操作時(shí)，我們建議洗滌介質(zhì)不超過(guò) 0.5 mL。在顆粒上輕輕沖洗這種洗滌介質(zhì)。 可能需要將細(xì)胞懸液抽入吸管并分裝數(shù)次.一旦細(xì)胞處于單細(xì)胞懸液中，可以加入剩余的洗滌液并將溶液離心。 |
| 由于與離心管壁粘附而導(dǎo)致洗滌過(guò)程中細(xì)胞的損失 | 細(xì)胞偶爾會(huì)粘在離心管的壁上。如果細(xì)胞確實(shí)粘附在聚苯乙烯管上，管子就會(huì)顯得渾濁。 換用另一批聚苯乙烯離心管或改用另一種塑料，如聚乙烯。聚苯乙烯管中發(fā)生這種問(wèn)題的情況最多，但其他類型的塑料也有報(bào)道出現(xiàn)細(xì)胞粘附的問(wèn)題。 |
材料
| 產(chǎn)品名稱 | 包裝規(guī)格 |
|---|---|
| Histopaque®-1077 | 100ML |
| 6x100ML | |
| 500ML | |
| Histopaque®-1083 | 100ML |
| 6x100ML | |
| Histopaque®-1119 | 100ML |
| 6x100ML | |
| Histopaque-1077,Histopaque-1119 | 100+100ML |
| Histopaque®-1077 Hybri-Max™ | 100ML |
| 500ML |
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