文獻解讀：ILC2在對抗寄生蟲感染和組織保護方面發(fā)揮非冗余作用新發(fā)現

新近的一些研究表明，神經元和免疫細胞共同合作來調節(jié)抗微生物免疫、炎癥和組織穩(wěn)態(tài)。例如，神經元變阻器提供興奮或抑制信號，控制黏膜屏障表面II型固有淋巴細胞（ILC2）的功能。ILC2則表達神經調節(jié)肽U（NMU）的受體NMUR1，NMU是一種膽堿能神經肽，可刺激ILC2增殖并產生II型細胞因子。

然而，ILC2與適應性淋巴細胞擁有許多共同功能。例如，它們都能產生II型細胞因子，釋放保護組織的雙調蛋白（AREG），在促進抗寄生蟲免疫、代謝穩(wěn)態(tài)和組織保護方面發(fā)揮著重要作用。這就引發(fā)了科學界的爭議，ILC2在體內是執(zhí)行冗余功能還是非冗余功能？

威爾·康奈爾醫(yī)學院領導的研究團隊利用一種新的遺傳工具，證明ILC2在保護屏障組織免受寄生蟲感染以及腸道損傷和炎癥后的組織保護方面發(fā)揮著非冗余作用。這項研究成果發(fā)表在《Nature》雜志上。
 

圖片來源：《Nature》
（https://www.nature.com/articles/s41586-022-05297-6）

研究材料與方法
在這項研究中，研究人員委托賽業(yè)生物構建了Nmur1^iCre-eGFP小鼠。這種新的遺傳工具能夠在適應性免疫系統(tǒng)存在的情況下，以ILC2為靶點進行基因敲除。在此基礎上，他們又構建了Areg^ΔILC2小鼠，以探究ILC2來源的AREG的潛在作用。他們利用小鼠腸道感染和炎癥模型及潰瘍性結腸炎患者的腸道樣本來分析AREG的功能，并在分析過程中采用了流式分選和免疫熒光染色等技術。

技術路線
01 構建Nmur1^iCre-eGFP小鼠，實現ILC2的特異性靶向
02 構建Areg^ΔILC2小鼠，實現ILC2特異性的Areg敲除
03 利用小鼠腸道感染和炎癥模型來分析ILC2來源的AREG的潛在功能
04 探究神經元產生的NMU是否能調節(jié)ILC2來源的AREG的功能

研究結果
1 一種新型的遺傳工具
為了描繪ILC2和適應性淋巴細胞的不同功能，研究人員根據NMUR1在ILC2上的表達模式，開發(fā)出一種在體內靶向ILC2的新型遺傳工具。他們委托賽業(yè)生物構建了Nmur1^iCre-eGFP小鼠，這種小鼠表達iCre重組酶和eGFP報告基因，它們位于Nmur1啟動子的下游（圖1）。他們發(fā)現，NMUR1–eGFP報告基因僅在ILC2中高表達，而在ILC1和ILC3亞群以及適應性淋巴細胞中的表達量極低甚至沒有。

為證實這些結果，研究人員構建了Nmur^1iCre-eGFPROSA26^LSL-RFP小鼠。在各種組織中，幾乎所有ILC2和ILC2前體都觀察到iCre誘導的RFP表達，而在其他免疫細胞中只有極少的誘導。此外，他們還構建了Nmur1^iCre-eGFPROSA26^LSL-DTR小鼠，這個品系能夠組成型表達白喉毒素受體。在注射白喉毒素后，小鼠多個組織中的ILC2幾乎被完全清除。這些數據表明，Nmur1^iCre-eGFP小鼠為報告Nmur1表達和體內多個組織中的ILC2特異性消融提供了一種新工具。
 

圖1 NMUR1–eGFP報告基因在ILC2中高表達^[1]

2 ILC2來源的AREG發(fā)揮非冗余功能
ILC2富集于包括腸道在內的屏障表面，通過釋放雙調蛋白（AREG）來介導組織修復和穩(wěn)態(tài)。為了研究ILC2來源的AREG的潛在非冗余作用，研究人員需要對Areg進行靶向敲除�？紤]到只有一小部分AREG⁺ ILC2共表達IL-5，但大多數AREG⁺ ILC2也表達NMUR1，他們認為，與Il5^Cre-tdTomato（Red5）小鼠品系相比，他們認為Nmur1^iCre-eGFP小鼠能夠實現ILC2中更靶向且更高效的Areg敲除。

為了驗證這一假設，他們構建了Areg^fl/-小鼠，將其與Red5或Nmur1^iCre-eGFP小鼠雜交，分別產生了Areg^ΔRed5和Areg^ΔILC2小鼠。對于Areg^ΔRed5小鼠，ILC2中AREG表達量沒有明顯下降，但對于Areg^ΔILC2小鼠，ILC2中AREG的表達幾乎完全缺失，實現了ILC2特異性的Areg敲除。

接下來，研究人員利用小鼠腸道感染和炎癥模型來檢驗AREG在體內是執(zhí)行冗余還是非冗余功能。他們觀察到，在鼠鞭蟲（Trichuris muris）感染野生型小鼠后，盲腸ILC2產生的AREG增加，表明ILC2來源的AREG可能在促進抗寄生蟲反應中發(fā)揮關鍵作用。與Areg^fl/-對照組相比，Areg^ΔILC2小鼠的ILC2中AREG表達量極低，而且感染后小鼠杯狀細胞的反應程度顯著降低（圖2），這與之前的研究一致，表明AREG可調節(jié)上皮細胞反應，包括分化為杯狀細胞來分泌粘液。同時，Areg^ΔILC2小鼠體內的寄生蟲數量也明顯多于Areg^fl/-小鼠。

考慮到TH2細胞和Treg細胞在某些情況下也能產生AREG，研究人員進一步分析了鼠鞭蟲感染后盲腸ILC2、Treg細胞和效應CD4⁺ T細胞產生AREG的動力學。從數量上看，ILC2和Treg細胞是AREG的主要來源，而產生AREG的CD4⁺ T細胞只占少數。與Areg^fl/-小鼠相比，Areg^ΔCD4小鼠（CD4⁺ T細胞區(qū)室缺乏AREG表達）在感染后的寄生蟲數量相當，這表明ILC2來源的AREG通過調節(jié)腸上皮細胞反應，在抗蠕蟲免疫中發(fā)揮著重要而非冗余的作用。

此外，ILC2也在腸道損傷后的組織保護中發(fā)揮著關鍵作用。不過，ILC2產生的AREG是否是促進組織保護機制所必需的，目前還不清楚。于是，研究人員將Areg^ΔILC2小鼠暴露在DSS下以誘導腸道損傷和炎癥。與Areg^fl/-對照組相比，Areg^ΔILC2小鼠表現出更嚴重的疾病，表現為體重明顯下降和腸上皮損傷（圖2）。這表明在缺乏ILC2來源的AREG的情況下，組織保護反應明顯受損，且其他細胞來源的AREG無法補償ILC2來源的AREG。由此可見，ILC2來源的AREG在非感染性腸道損傷和炎癥中介導了組織保護的非冗余作用。
 

圖2 ILC2來源的AREG對清除寄生蟲和腸道損傷后的組織保護至關重要^[1]

3 NMU誘導人類和小鼠ILC2產生AREG
最近的研究發(fā)現了多種神經肽，它們可在屏障表面對ILC2功能進行正向或負向調節(jié)，例如，NMU可促進ILC2產生II型細胞因子。那么，NMU是否能調節(jié)ILC2來源的AREG的非冗余組織保護功能呢？研究人員觀察到，對于暴露于DSS和鼠鞭蟲感染的小鼠，結腸內Nmu的表達顯著增加，且Nmu的表達僅限于腸神經元亞群。

在小鼠體內注射NMU會導致ILC2產生的AREG增加，但不會導致CD4⁺ T細胞產生的AREG增加（圖3）。與此一致的是，與對照組相比，暴露于DSS的小鼠注射NMU后，上皮隱窩結構得到改善，因此疾病嚴重程度大大減輕（圖3）。由于Areg^ΔILC2小鼠在接受NMU處理后腸上皮結構沒有得到改善，他們認為NMU的組織保護作用依賴于ILC2來源的AREG。這些數據表明，炎癥誘導神經元產生的NMU和ILC2介導的組織保護之間存在關聯。

最后，研究人員試圖以人類腸道炎癥為背景，看看MNU和ILC2–AREG軸之間是否存在關聯。與小鼠腸道炎癥模型中的結果一致，潰瘍性結腸炎患者腸道樣本中的NMU表達相對于健康樣本增加。而且，對于從炎癥性腸病患者腸活檢樣本中分離出的ILC2，體外NMU刺激導致AREG的上調（圖3）。由此可見，NMU調節(jié)的ILC2-AREG反應是一種進化保守的組織保護機制，在腸道損傷和炎癥發(fā)生時激活。
 

圖3 NMU介導了ILC2來源的AREG的非冗余組織保護功能^[1]

研究結論
研究人員總結道，利用新的遺傳工具，他們證明了在適應性免疫反應起作用的情況下，腸道粘膜屏障的損傷會導致腸神經元中NMU上調，而NMU會刺激結腸ILC2產生AREG。通過這條由NMU調節(jié)的ILC2-AREG通路，ILC2在促進抗寄生蟲免疫以及組織保護方面發(fā)揮了重要的非冗余作用，這有望為多種感染和炎癥的治療提供新的見解。

參考文獻：
[1]Tsou, A.M., Yano, H., Parkhurst, C.N. et al. Neuropeptide regulation of non-redundant ILC2 responses at barrier surfaces. Nature 611, 787–793 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05297-6