EVIDENT共聚焦/超分辨助力Nature發(fā)文揭示應(yīng)激顆粒亞型鑒定范式
本文作者：尚澤華
四川大學(xué)生物治療全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室賈大課題組
應(yīng)激顆粒（SGs）是真核細(xì)胞在應(yīng)對(duì)缺氧、熱休克、病毒感染和氧化應(yīng)激等各種應(yīng)激時(shí)形成的無膜 RNA 顆粒1。SGs 的形成會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞新陳代謝的重新規(guī)劃、翻譯的抑制以及正常細(xì)胞信號(hào)的改變，從而幫助細(xì)胞存活。SG 是通過一種稱為液-液相分離（LLPS）的物理過程形成的，其中包含許多蛋白質(zhì)，包括小核糖體亞基、翻譯起始因子、翻譯受阻的 mRNA 和 RNA 結(jié)合蛋白2。最近發(fā)現(xiàn)了一個(gè)由 36 個(gè) SG 蛋白組成的核心 SG 網(wǎng)絡(luò)，其中 G3BP1/2 是中心節(jié)點(diǎn)3。這些蛋白對(duì)調(diào)節(jié) SG 的組裝和功能至關(guān)重要。在許多病理情況下，如病毒感染4-8、神經(jīng)退行性疾病9-11和癌癥12、13等，SG的組裝和分解失調(diào)都會(huì)發(fā)生，這突出了SG在人類疾病中的重要性。最近的研究發(fā)現(xiàn)，不同類型的應(yīng)激會(huì)誘導(dǎo)不同的 SG 亞型，這些亞型在組成、組裝和解體的動(dòng)態(tài)以及細(xì)胞功能方面各不相同14。例如，亞砷酸鈉或熱休克處理會(huì)誘導(dǎo)形成典型的 SG，這種 SG 更具有活力，能起到促進(jìn)生存的作用15。與此相反，亞硒酸鈉等化療藥物或紫外線照射會(huì)導(dǎo)致非典型 SG 的形成，這種 SG 的動(dòng)態(tài)性較弱，對(duì)細(xì)胞有促進(jìn)凋亡的作用15、16。盡管應(yīng)激特異性 SG 亞型的概念正在形成7、15、17-19，但它們不同的蛋白質(zhì)和 RNA 組成及功能在很大程度上仍未得到探索。
2024年5月15日，四川大學(xué)生物治療全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室賈大課題組與合作者在Nature communications雜志( IF=16.6 (2023) / JCR分區(qū): Q1 )在線發(fā)表了題為“TRIM25 predominately associates with anti-viral stress granules“ 的研究論文。該工作利用 G3BP1 鄰近蛋白生物素化標(biāo)記實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) TRIM25 是抗病毒 SG 的有效標(biāo)記物。課題組成員發(fā)現(xiàn) TRIM25 會(huì)獨(dú)立發(fā)生 LLPS 現(xiàn)象，而 dsRNA 的存在會(huì)顯著增強(qiáng)這種反應(yīng)。Poly(I:C)處理和RNA病毒感染都會(huì)引發(fā)TRIM25和G3BP1的共相分離，從而顯著提高TRIM25對(duì)底物的泛素化活性，其中許多底物都定位于SGs中。TRIM25和G3BP1的共相分離對(duì)激活RIG-I信號(hào)通路和限制RNA病毒感染至關(guān)重要。該研究不僅為抗病毒信號(hào)通路的調(diào)控提供了新的見解，而且為研究應(yīng)激特異性 SG 亞型的組成、動(dòng)態(tài)和功能建立了一個(gè)研究范式。
該研究首先采用了一種鄰近生物素化標(biāo)記（BioID）方法（圖1）來鑒定poly(I:C)刺激下的 G3BP1 相互作用網(wǎng)絡(luò)。在 937 個(gè)差異蛋白中，有 181 個(gè)屬于以前鑒定的 SG 蛋白成分，包括許多 SG 核心蛋白，如 HDAC6 和 DDX3X。有趣的是，TRIM25在所有蛋白中增加最為顯著，它是一個(gè)泛素化依賴性抗病毒先天免疫反應(yīng)的驅(qū)動(dòng)蛋白，經(jīng) poly(I:C) 處理后富集了 130 倍（圖1）。這意味著，poly(I:C) 處理會(huì)刺激 TRIM25 被招募到 SG（即抗病毒 SG）中。
(A) G3BP1 BioID 方法與基于 TMT 的定量蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合的示意圖。(B) 如(A)中所確定的，由 poly(I:C) 處理誘導(dǎo)的 SGs 核心蛋白列表。
(A) 具有代表性的熒光顯微鏡圖像顯示了在各種應(yīng)激條件下 TRIM25 與 HeLa 細(xì)胞中內(nèi)源性 G3BP1 的共定位。(B) TRIM25 和 G3BP1 病灶之間的最短距離。在 HeLa 細(xì)胞中，各種應(yīng)激類型如（A）所示。在所有應(yīng)激類型中，Sev 感染和 poly(I:C) 處理導(dǎo)致的距離最短。
(A) 轉(zhuǎn)染 poly(I:C) 后 G3BP1（綠色）和 TRIM25 WT 或 ∆PTFG （紅色）點(diǎn)狀顆粒形成的延時(shí)顯微照片，以及轉(zhuǎn)染后 6 小時(shí)或 10 小時(shí)斑點(diǎn)的放大圖像。比例尺：10 µm。插圖：白色框內(nèi)區(qū)域的放大圖。(B) TRIM25 的 PTFG 基序是與 HeLa 細(xì)胞中的 G3BP1 共定位所必需的。細(xì)胞轉(zhuǎn)染了 GFP-TRIM25 ∆PTFG 而不是 TRIM25 WT。比例尺：10 μm。
(A-D) 用 TRIM25 WT、TRIM25 PTFGAAAA或∆PTFG轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，然后用poly(I:C) 處理 12 小時(shí)。用qPCR測定IFNα (A)、IFNβ (B)、IFNγ (C)和ISG56 (D)的 mRNA 水平。
本文中多色熒光標(biāo)記的細(xì)胞圖像都是采用Evident激光掃描共聚焦FV3000拍攝。FV3000的全真光譜技術(shù)可以自由調(diào)整標(biāo)記熒光信號(hào)的收集波段，并有效防止不同標(biāo)記之間的熒光串?dāng)_，幫助用戶獲取更加真實(shí)可靠的數(shù)據(jù)。另外，本文還利用FV3000觀察了活細(xì)胞中的G3BP1液滴以及通過FRAP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其相分離特性。FV3000靈活高效的龍卷風(fēng)光刺激模式以及追蹤運(yùn)動(dòng)中的液滴并分析其漂白區(qū)域熒光強(qiáng)度變化的功能，是幫助用戶進(jìn)行相分離研究的利器。（Evident新一代激光掃描共聚焦系統(tǒng)FV4000現(xiàn)已發(fā)布。）
文章中的活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)采用了Evident轉(zhuǎn)盤共聚焦超分辨系統(tǒng)SpinSR，其高速、高分辨率和低光毒性的特點(diǎn)，適合對(duì)快速動(dòng)態(tài)變化的活細(xì)胞進(jìn)行長時(shí)程觀察。
四川大學(xué)生物治療全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室賈大研究員與四川大學(xué)基礎(chǔ)與法醫(yī)學(xué)院Peng Bai為本文的共同通訊作者。碩士生尚澤華，博士生張思韜、王瑾瑞為本文共同第一作者，蘇州大學(xué)博士生周莉莉、四川大學(xué)華西生物治療國重創(chuàng)新班本科生張欣悅也為本研究做出重要貢獻(xiàn)。本研究還得到了周芳芳、楊培國、Daniel D. Billadeau、張令強(qiáng)等教授的大力支持，并得到了李丕龍教授的指導(dǎo)和幫助。
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