常用的報(bào)告基因及報(bào)告基因工具鼠的構(gòu)建方法介紹

前言
在生物醫(yī)學(xué)研究中，精準(zhǔn)定位想要研究的目的基因或細(xì)胞是至關(guān)重要的。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，報(bào)告基因工具鼠成為了不可或缺的研究工具。然而，面對(duì)種類如此繁多的報(bào)告基因工具鼠，“科研汪”們早已眼花繚亂，選擇困難癥都犯了...別怕，小編今天就來為您答疑解惑啦！希望能幫您找到合適的“小幫手”，順利開啟科研之路！

什么是報(bào)告基因工具鼠？
報(bào)告基因工具鼠，顧名思義就是攜帶報(bào)告基因（reporter gene）的小鼠模型，它是利用基因工程技術(shù)手段，將報(bào)告基因整合到小鼠的基因組中構(gòu)建而成。當(dāng)報(bào)告基因表達(dá)時(shí)，我們可以借助實(shí)驗(yàn)儀器觀察到其在組織或細(xì)胞水平的表達(dá)情況，從而實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)進(jìn)行基因表達(dá)監(jiān)測、細(xì)胞標(biāo)記和譜系示蹤等研究。

報(bào)告基因工具鼠在許多研究領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用。在發(fā)育生物學(xué)研究中，研究人員可以利用報(bào)告基因工具鼠來觀察特定基因在胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)模式，從而揭示胚胎發(fā)育的機(jī)制。在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，報(bào)告基因工具鼠可以幫助科學(xué)家研究神經(jīng)元的發(fā)育和連接，揭示大腦功能和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的機(jī)制。在免疫學(xué)研究中，報(bào)告基因工具鼠可以用來研究免疫細(xì)胞的分化和活化過程，探索免疫應(yīng)答的調(diào)控機(jī)制。
 

圖1. 報(bào)告基因工具鼠的部分應(yīng)用場景[1]

體內(nèi)研究常用的報(bào)告基因有哪些？
報(bào)告基因是那些能編碼某種易于檢測蛋白質(zhì)或酶的基因，通過它的表達(dá)產(chǎn)物便捷、可靠、靈敏的來標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控。體內(nèi)研究常用的報(bào)告基因包括β-半乳糖苷酶、熒光蛋白、熒光素酶等。
 

β-半乳糖苷酶

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-gal）由大腸埃希菌LacZ基因編碼，是一種由四個(gè)四聚體組成的酶，每個(gè)四聚體的分子量為465kDa，可將無色化合物X-gal切割成半乳糖和深藍(lán)色物質(zhì)：5-溴-4-靛藍(lán)。β-ga1常用于整體胚胎或組織切片的基因表達(dá)研究，因?yàn)槔��?beta;-gal進(jìn)行胚胎的全身染色，可以充分了解某一基因在體內(nèi)的表達(dá)譜全貌。
 

圖2. 利用lacZ檢測Lgr5基因的表達(dá)情況[6]
 

熒光蛋白

熒光蛋白家族（fluorescent protein family）是從水螅蟲綱和珊瑚類動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的相對(duì)分子質(zhì)量為(2～3)×104的同源蛋白，包括綠色、紅色、黃色和青色熒光蛋白等，其中綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是應(yīng)用最多的熒光蛋白。

熒光蛋白的發(fā)光原理在于其發(fā)色基團(tuán)經(jīng)一定波長的光（激發(fā)光）照射后被激活，并將能量以光能形式釋放，這時(shí)我們就能在熒光顯微鏡下看到日思夜想的熒光色啦！熒光蛋白常用于研究目的基因表達(dá)，蛋白質(zhì)運(yùn)輸以及各種細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)的生物化學(xué)信號(hào)通路等。
 

圖3. 利用熒光蛋白研究心臟發(fā)育或再生機(jī)制[7]
 

熒光素酶

熒光素酶（luciferase）是生物體內(nèi)催化不同底物(如熒光素、腔腸素等)發(fā)射出熒光或催化脂肪醛氧化發(fā)光的一類酶的總稱，其中最具代表性的是螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase，F(xiàn)luc）和海腎熒光素酶（renilla luciferase，Rluc）。

螢光素酶可以催化自身底物氧化，在氧化過程中，一部分能量以光子形式被釋放，從而發(fā)出生物熒光。只有活細(xì)胞內(nèi)才會(huì)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，且光的強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目成正比。因此，熒光素酶自發(fā)光的活體成像技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及藥物開發(fā)等領(lǐng)域。
 

圖4. 活體成像示蹤Il1a細(xì)胞因子的表達(dá)。
 

不同類型報(bào)告基因具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)（見表1）。在實(shí)際運(yùn)用中，須結(jié)合研究的目的、信號(hào)檢測的時(shí)間性與空間性、首選的檢測方法、組織與細(xì)胞的類別等選擇適合的報(bào)告基因系統(tǒng)。

表1.體內(nèi)研究常用報(bào)告基因的優(yōu)缺點(diǎn)

如何將報(bào)告基因整合到小鼠基因組中？
一般而言，將外源基因引入小鼠基因組的方法有兩種：轉(zhuǎn)基因和基因敲入。

1.轉(zhuǎn)基因
(1) 隨機(jī)轉(zhuǎn)基因
將含有報(bào)告基因的外源DNA片段克隆至PiggyBac（PB）轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒中，與轉(zhuǎn)座酶一起注射到小鼠受精卵中。在轉(zhuǎn)座酶作用下，外源DNA片段將會(huì)被整合到基因組上的TTAA位點(diǎn)處，從而獲得表達(dá)報(bào)告基因的小鼠。
 

圖5. PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)
 

雖然利用PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將外源基因敲入在轉(zhuǎn)座酶識(shí)別位點(diǎn)，可以提高轉(zhuǎn)基因的表達(dá)陽性率，但依然避免不了隨機(jī)轉(zhuǎn)基因隨機(jī)整合的缺點(diǎn)。難道就沒有一種既能明確而準(zhǔn)確地插入外源基因又能保證表達(dá)的方法嗎？答案是有的，那就是小編接下來要介紹的定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因。

(2) 定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因
定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因的關(guān)鍵就在于“定點(diǎn)”，Rosa26位點(diǎn)是目前最為常用的定點(diǎn)整合位點(diǎn)之一，將攜帶報(bào)告基因的DNA序列插入到小鼠的Rosa26位點(diǎn)上，可以保證報(bào)告基因在小鼠體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。

在組成型表達(dá)的基礎(chǔ)上，我們還可以借助重組酶系統(tǒng)構(gòu)建條件性表達(dá)報(bào)告基因的小鼠模型。以Cre/loxP系統(tǒng)為例，首先在啟動(dòng)子和報(bào)告基因之間插入轉(zhuǎn)錄終止盒（lox-stop-lox）構(gòu)建Flox鼠，同時(shí)構(gòu)建特異性Cre鼠（由特定啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，可在特定細(xì)胞或組織表達(dá)Cre重組酶）。將上述兩種小鼠交配后，子代中可以獲得既帶有Cre又帶有Flox基因的小鼠，在表達(dá)Cre重組酶的細(xì)胞或組織中，終止盒被Cre重組酶切除，因此僅在這些細(xì)胞或組織中才會(huì)表達(dá)報(bào)告基因。
 

圖6. 條件性表達(dá)報(bào)告基因小鼠的構(gòu)建示意圖[8]

2.基因敲入
與轉(zhuǎn)基因不同，基因敲入是在小鼠內(nèi)源基因的特定位點(diǎn)插入報(bào)告基因，可以更好地研究該基因的功能和調(diào)控機(jī)制。想要將外源報(bào)告基因敲入小鼠的內(nèi)源基因，有以下三種方式：
 

圖7. 基因敲入方式構(gòu)建報(bào)告基因工具鼠策略圖。

融合表達(dá)
將報(bào)告基因敲入到小鼠內(nèi)源基因的5'端或3'端，與內(nèi)源基因融合表達(dá)。

共表達(dá)
共表達(dá)的構(gòu)建方式是將報(bào)告基因通過2A（自剪切多肽）或IRES（內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列）元件敲入到小鼠內(nèi)源基因的3'端。

取代表達(dá)
取代表達(dá)的構(gòu)建方式則是用報(bào)告基因取代小鼠本身的基因，使敲除和敲入同時(shí)發(fā)生。

想必大家在選用共表達(dá)時(shí)，還會(huì)糾結(jié)IRES和2A元件要怎么選擇。小編對(duì)IRES和2A元件的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了簡要總結(jié)，供大家參考~

1  IRES
優(yōu)點(diǎn)：IRES上下游的兩個(gè)蛋白可以同時(shí)表達(dá)，并且翻譯出的兩個(gè)蛋白是完全獨(dú)立的。
缺點(diǎn)：IRES的序列較長（約600bp），其應(yīng)用常受到載體容量的限制。此外，IRES前后兩個(gè)蛋白無法實(shí)現(xiàn)等量表達(dá)。通常情況下，下游蛋白的表達(dá)量僅為上游蛋白的10%~50%。

2  2A
優(yōu)點(diǎn)：2A肽長度小且剪切效率極高，能夠?qū)崿F(xiàn)多蛋白的等量表達(dá)。
缺點(diǎn)：上游蛋白會(huì)多出20余個(gè)氨基酸的多肽尾巴，下游蛋白會(huì)在N端多出一個(gè)脯氨酸。這種額外增加的2A肽結(jié)構(gòu)可能會(huì)對(duì)目的蛋白的功能造成一定的影響。

圖8. 連接元件IRES和2A的作用原理[9]

由于IRES和2A肽都有著各自的優(yōu)缺點(diǎn)，建議參考目的蛋白的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，或依照經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行構(gòu)建。

Reference：
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[8] Cazemier JL, Clascá F, Tiesinga PH. Connectomic Analysis of Brain Networks: Novel Techniques and Future Directions. Front Neuroanat. 2016;10:110. Published 2016 Nov 9. doi:10.3389/fnana.2016.00110

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