彗星電泳法檢測DNA損傷方法介紹

瀏覽次數(shù)：838　發(fā)布日期：2023-7-18　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

實驗原理：

當(dāng)各種內(nèi)源性和外源性因素誘發(fā)細(xì)胞DNA鏈斷裂時，其超螺旋結(jié)構(gòu)受到破壞，在細(xì)胞裂解液作用下，細(xì)胞膜、核膜等膜結(jié)構(gòu)受到破壞，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、RNA以及其他成分均擴(kuò)散到電解液中，而核DNA由于分子量太大不能進(jìn)入凝膠而留在原位。

檢測方法：

- 中性處理：在中性條件下，DNA維持雙鏈構(gòu)象，因而僅可以檢測雙鏈斷裂。
- 堿性處理：在堿性電解質(zhì)的作用下，DNA發(fā)生解螺旋，損傷的DNA斷鏈及片段被釋放出來。由于這些DNA的相對分子質(zhì)量小且堿變性為單鏈，所以在電泳過程中帶負(fù)電荷的DNA會離開核DNA向正極遷移形成彗星狀圖像。

實驗操作：

1、將細(xì)胞固定于低熔點(diǎn)瓊脂糖中；
2、用裂解液破壞細(xì)胞膜；
3、再用堿溶液使DNA分子解旋；
4、將載玻片置于電泳液中，在電場的作用下，DNA分子向陽極移動。

結(jié)果分析：

1、如果DNA損傷嚴(yán)重，則產(chǎn)生的碎片就越多、越小，向陽極遷移的DNA碎片量就越多，遷移距離也越長，熒光染色后就能看見“彗星”樣尾長并且熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。
2、未受損傷的DNA大分子則由于細(xì)胞膜的阻隔，滯留在原處。

圖1．引自文獻(xiàn)

數(shù)據(jù)處理：

1、在拍照時以tif格式保存圖片，然后點(diǎn)擊下圖的綠色框選的位置導(dǎo)入文件。
2、打開view下拉菜單，選“resultwindow”，在分析后您就可以看到您的結(jié)果窗口。分析之前最好把右側(cè)的head和tail選中，(紅色框選部分，這樣可以出現(xiàn)頭、尾分明的視覺效果)

3、用白色畫框選中要分析的區(qū)域

4、圖中數(shù)字表示：
1是翻頁，2是分析，3是保存，4是調(diào)整背景調(diào)整，5是進(jìn)入正式分析
調(diào)整好位置后，開始分析前要點(diǎn)擊“5”，然后點(diǎn)“ 2”，再點(diǎn)“ 3 ”，這樣一張圖的數(shù)據(jù)就分析完了，數(shù)據(jù)會保存在系統(tǒng)里。點(diǎn)擊“翻頁”可以繼續(xù)分析下一張圖。
綠色框選所指區(qū)域是分析后的曲線，主曲線圖下面列舉了幾個數(shù)據(jù)，全部結(jié)果在結(jié)果窗口。
5、將分析窗口最小化(點(diǎn)擊下圖紅色框選部分)可以預(yù)覽分析好的數(shù)據(jù)