光聲應用：腎小管間質(zhì)纖維化診斷
背景
慢性腎病，以其高發(fā)生率和強大的潛伏性，已越來越成為一種常見的疾病。如果能夠及時地檢測到該疾病的發(fā)生進程，將大大改善后續(xù)的治療效果。在眾多病理特征中，腎小管間質(zhì)纖維化（Tubulointerstitial fibrosis）作為眾多腎臟疾病發(fā)展進程中的常見中間體，是反映腎臟狀態(tài)的重要指標。目前，臨床治療方法仍然只能做到減緩病程，并不能阻止或者扭轉(zhuǎn)疾病對于組織的破壞。因此，醫(yī)療和科研工作人員將注意力放在了疾病的早期階段——如果能在該階段確定病變，則有更大的幾率阻止疾病惡化。
研究思路
在此背景下，Dingyuan等人嘗試對腎小管間質(zhì)纖維化進行實時檢測。傳統(tǒng)的方法使用的腎活組織切片（Kidney biopsy）容易導致大量出血，因而作者更偏向于非接觸式檢測。而在該領域，通常選用CT、核磁共振等方式，但這些方式輻射風險相對較大，因此作者最終選擇了光聲/熒光成像方式。而在顯影劑的選擇上，相對于無機材料，有機材料具有更好的生物降解能力、純度以及聚集誘導發(fā)光效應（Aggregation-induced emission, AIE）——一種在溶液中分散時幾乎不發(fā)光，但在聚集狀態(tài)時發(fā)光大大增強的現(xiàn)象——因而被作者看中。同時，現(xiàn)有的大部分具有AIE的光聲顯影劑為疏水性材料，不利于均勻分散和體內(nèi)代謝，因此作者開發(fā)了一款水溶性AIE腎小管間質(zhì)纖維化檢測顯影劑。
顯影劑設計及表征
作者首先獲得的是AIE-4COOH分子——一個攜帶4個羧基的具有AIE效應的分子。為了增加其水溶性，作者將4個羧基全部PEG化，成為AIE-4PEG550。AIE-4PEG550在DMSO/水體系中溶解良好，并能夠自組裝形成納米粒子（AIE-4PEG550 NPs，圖1）。表征結(jié)果顯示該粒子有以下兩個優(yōu)點：一、粒徑約26 nm，質(zhì)量約3.3 kDa，能夠有效通過腎臟的濾過作用（截留質(zhì)量通常為30-50 kDa）；二、光穩(wěn)定性好：在660 nm波長持續(xù)照射30 min后，僅有微小強度下降，而作為對照的顯影劑ICG則已完全猝滅。在645 nm處具有最強吸收峰，而發(fā)射峰則在893 nm。
圖1 AIE-4PEG550納米粒子設計思路
體外和體內(nèi)實驗
體外實驗著眼于該有機分子的生物兼容性。在0 – 100 μg/mL該分子溶液中孵育24 h后，HK-2細胞（Human kidney -2，人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細胞）的存活率仍在95%以上（圖3）。
在正常體內(nèi)實驗中，作者同時進行了熒光和光聲成像，相互驗證了該顯影劑主要聚集于腎臟而非肝臟（圖4），隨著時間流逝，腎臟中的含量逐漸降低，膀胱中的含量逐漸增加，表明該顯影劑可由腎臟代謝，并由尿液排出。測得的24 h清除效率為93.1 ± 1.7%（圖5）。
圖4 在注射顯影劑后，腎臟的熒光（A）和光聲（B）、膀胱的熒光（C）和光聲（D）隨時間的成像效果變化。在腎臟中，4 min達到頂峰，而在膀胱中，60 min達到頂峰。E和F分別為相應的數(shù)值變化柱狀圖
而在腎病模型小鼠上，同樣的劑量表現(xiàn)出截然不同的結(jié)果：直到180 min之前，腎臟中的顯影劑含量一直在增加，說明腎臟代謝功能降低，本該快速代謝到膀胱的化合物積聚在腎臟中（圖6），這一現(xiàn)象也在相應的熒光信號強度上有所驗證（圖7）。通過這種區(qū)別，能夠較為直觀地評估腎臟代謝功能。
小結(jié)
慢性腎病，以其高發(fā)生率和強大的潛伏性，已越來越成為一種常見的疾病。如果能夠及時地檢測到該疾病的發(fā)生進程，將大大改善后續(xù)的治療效果。在眾多病理特征中，腎小管間質(zhì)纖維化（Tubulointerstitial fibrosis）作為眾多腎臟疾病發(fā)展進程中的常見中間體，是反映腎臟狀態(tài)的重要指標。目前，臨床治療方法仍然只能做到減緩病程，并不能阻止或者扭轉(zhuǎn)疾病對于組織的破壞。因此，醫(yī)療和科研工作人員將注意力放在了疾病的早期階段——如果能在該階段確定病變，則有更大的幾率阻止疾病惡化。
研究思路
在此背景下，Dingyuan等人嘗試對腎小管間質(zhì)纖維化進行實時檢測。傳統(tǒng)的方法使用的腎活組織切片（Kidney biopsy）容易導致大量出血，因而作者更偏向于非接觸式檢測。而在該領域，通常選用CT、核磁共振等方式，但這些方式輻射風險相對較大，因此作者最終選擇了光聲/熒光成像方式。而在顯影劑的選擇上，相對于無機材料，有機材料具有更好的生物降解能力、純度以及聚集誘導發(fā)光效應（Aggregation-induced emission, AIE）——一種在溶液中分散時幾乎不發(fā)光，但在聚集狀態(tài)時發(fā)光大大增強的現(xiàn)象——因而被作者看中。同時，現(xiàn)有的大部分具有AIE的光聲顯影劑為疏水性材料，不利于均勻分散和體內(nèi)代謝，因此作者開發(fā)了一款水溶性AIE腎小管間質(zhì)纖維化檢測顯影劑。
顯影劑設計及表征
作者首先獲得的是AIE-4COOH分子——一個攜帶4個羧基的具有AIE效應的分子。為了增加其水溶性，作者將4個羧基全部PEG化，成為AIE-4PEG550。AIE-4PEG550在DMSO/水體系中溶解良好，并能夠自組裝形成納米粒子（AIE-4PEG550 NPs，圖1）。表征結(jié)果顯示該粒子有以下兩個優(yōu)點：一、粒徑約26 nm，質(zhì)量約3.3 kDa，能夠有效通過腎臟的濾過作用（截留質(zhì)量通常為30-50 kDa）；二、光穩(wěn)定性好：在660 nm波長持續(xù)照射30 min后，僅有微小強度下降，而作為對照的顯影劑ICG則已完全猝滅。在645 nm處具有最強吸收峰，而發(fā)射峰則在893 nm。
圖1 AIE-4PEG550納米粒子設計思路圖2 AIE-4PEG550 NPs的左）吸收、發(fā)射圖譜；右）粒徑檢測（溶液均為水）
體外和體內(nèi)實驗
體外實驗著眼于該有機分子的生物兼容性。在0 – 100 μg/mL該分子溶液中孵育24 h后，HK-2細胞（Human kidney -2，人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細胞）的存活率仍在95%以上（圖3）。
圖3 在不同濃度AIE-4PEG550 NPs環(huán)境下孵育的HK-2細胞存活率
在正常體內(nèi)實驗中，作者同時進行了熒光和光聲成像，相互驗證了該顯影劑主要聚集于腎臟而非肝臟（圖4），隨著時間流逝，腎臟中的含量逐漸降低，膀胱中的含量逐漸增加，表明該顯影劑可由腎臟代謝，并由尿液排出。測得的24 h清除效率為93.1 ± 1.7%（圖5）。
圖4 在注射顯影劑后，腎臟的熒光（A）和光聲（B）、膀胱的熒光（C）和光聲（D）隨時間的成像效果變化。在腎臟中，4 min達到頂峰，而在膀胱中，60 min達到頂峰。E和F分別為相應的數(shù)值變化柱狀圖圖5 腎臟清除效率隨注射后時間變化曲線（每只小鼠200 μg劑量，n = 3）
而在腎病模型小鼠上，同樣的劑量表現(xiàn)出截然不同的結(jié)果：直到180 min之前，腎臟中的顯影劑含量一直在增加，說明腎臟代謝功能降低，本該快速代謝到膀胱的化合物積聚在腎臟中（圖6），這一現(xiàn)象也在相應的熒光信號強度上有所驗證（圖7）。通過這種區(qū)別，能夠較為直觀地評估腎臟代謝功能。
圖6 在注射顯影劑后，腎臟的熒光（A）和光聲（B、C）、膀胱的熒光（D）和光聲（E、F）隨時間的成像效果變化。
圖7 腎病模型小鼠注射顯影劑后180 min的熒光信號強度變化（紅：腎臟；藍：膀胱）
小結(jié)
作者設計并開發(fā)了一種新型熒光/光聲顯影劑，其優(yōu)點主要有：一、體積小，可通過腎臟過濾；二、高效的腎臟清除效率；三、得益于AIE效應，成像效果優(yōu)異；四、良好的生物兼容性；五、優(yōu)良的光穩(wěn)定性。在文獻中，作者將其應用于非侵入式地診斷腎小管間質(zhì)纖維化情況，祝愿在不久的將來，這項技術可以用于臨床，幫助醫(yī)生快速診斷腎臟功能，從而幫助患者更好地恢復。
參考文獻
[1] Yan, D., Li, T., Yang, Y., Niu, N., Wang, D., Ge, J., Wang, L., Zhang, R., Wang, D. and Tang, B.Z. (2022), A Water-soluble AIEgen for Noninvasive Diagnosis of Kidney Fibrosis via SWIR Fluorescence and Photoacoustic Imaging. Adv. Mater.. Accepted Author Manuscript 2206643. https://doi.org/10.1002/adma.202206643
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