單細胞多組學思路在研究腫瘤異質性中的應用

腎透明細胞癌（ccRCC）是腎細胞癌中最常見也最具侵襲性的癌癥亞型，容易術后復發(fā)和轉移，預后較差。目前，ccRCC的治療方法主要包括常規(guī)化療、靶向治療和免疫治療，但療效受到腫瘤異質性的影響。因此，有必要了解ccRCC的細胞和分子機制，以促進biomarker的發(fā)現和指導臨床干預。

本文中，研究者利用單細胞測序技術，結合多組學聯合分析思路，繪制了ccRCC原發(fā)腫瘤組織的轉錄和表觀基因組圖譜，揭示了腫瘤特異的調控信號和免疫細胞功能相關的多個轉錄因子（TFs），為剖析ccRCC的異質性及鑒定潛在治療靶點提供了重要見解。

 

文章詳情

文章題目：Single-cell multiomics analysis reveals regulatory programs in clear cell renal cell carcinoma

中文題目：單細胞多組學分析揭示腎透明細胞癌的調控程序

發(fā)表時間：2022.07

期刊名稱：Cell Discovery

影響因子：38.079

實驗平臺：10x Chromium 單細胞轉錄組測序+單細胞ATAC測序

DOI：10.1038/s41421-022-00415-0

 

研究內容

⏩ 單細胞水平分析ccRCC中的轉錄組和染色質可及性

為了探究ccRCC腫瘤的異質性，研究者對三名患者進行了單細胞轉錄組+單細胞ATAC測序，并額外對一名患者進行單細胞轉錄組測序（所有患者均攜帶VHL基因的突變）。經過質量控制篩選，共獲得38097個細胞的轉錄組和21272個細胞的染色質可及性信息，并基于marker基因注釋到15種細胞類型。對于單細胞ATAC測序結果，基于marker基因啟動子區(qū)域的可及性進行細胞注釋，并將結果與單細胞轉錄組結果比較和聯合分析，最終注釋到12種細胞類型。這12種細胞類型包括5種淋巴細胞、巨噬細胞、單核細胞、肥大細胞、內皮細胞（VCAM+和VCAM-）、系膜細胞和腫瘤細胞（基于marker基因和infer CNV分析結果注釋得到）。在ccRCC整個腫瘤微環(huán)境（TME）中，免疫細胞占比最高，腫瘤細胞不到10%，且細胞豐度在不同患者內有所不同。綜上所述，將單細胞轉錄組和單細胞ATAC測序結果整合分析揭示了ccRCC中細胞組成的異質性。

Fig.1 人ccRCC單細胞水平的轉錄和染色質可及性圖譜

 

⏩ ccRCC中的腫瘤特異性調控元件

對單細胞染色質可及性進行差異分析發(fā)現共有22682個獨特的peak在不同細胞類型具有顯著差異，并將其命名為DARs。大多數 DARs 位于基因組的啟動子和內含子區(qū)域，并且其分布在不同細胞類型中相對保守。此外，研究者發(fā)現腫瘤細胞的DARs和差異表達基因（DEGs）主要富集在代謝相關的生物學過程中。接下來，研究者利用算法篩選出在腫瘤細胞中富集的高特異性TFs，并鑒定出49個TFs在腫瘤細胞里的活性高于其他細胞類型。利用TCGA數據庫中的ccRCC（TCGA-KIRC）隊列數據分析這些腫瘤特異性TFs與患者預后的關系，發(fā)現腫瘤特異性TFs高表達的患者的總生存率和無病生存率更差。接下來，研究者從中挑選出四個表達水平與較差的總生存率顯著相關的TFs（HOXC5、VENTX、ISL1和OTP，它們的結合位點位于ATAC測序得到的染色質可及區(qū)域里）進行分析，發(fā)現它們調控多種腫瘤特異性基因，致使其在腫瘤中的表達水平顯著上升。而敲除這些TFs基因可顯著降低腫瘤細胞增殖并增加細胞死亡。為了尋找針對這些TFs的候選藥物，研究者使用了LINCS consortium找到了2個候選藥物能顯著降低HOXC5、VENTX和ISL1的表達水平，同時顯著降低了腫瘤細胞的增殖率。

Fig.2 鑒定腫瘤特異性調控元件

Fig.3 四種腫瘤特異性TFs的特性研究

 

⏩ ccRCC內的惡性轉錄程序

研究者從四個樣品中選出3564個腫瘤細胞來分析ccRCC中基因表達模式在不同惡性細胞中是如何變化的，并發(fā)現在這些腫瘤細胞中持續(xù)存在多種不同的轉錄狀態(tài)。利用NMF法來定義了11個腫瘤內轉錄程序，進一步聚類分層確定了2個元程序，它們包含了四個樣品中高度相似的程序。利用通路富集分析來確認這2個元程序的生物學功能發(fā)現元程序1的基因顯著富集于應激相關途徑，而元程序2基因主要參與代謝相關的生物過程。再次結合TCGA-KIRC隊列數據檢驗預后相關性發(fā)現元程序1高表達的患者總存活率較差，而元程序2高表達的患者總存活率較好。分析上文中鑒定到的四個腫瘤特異性TFs和這2個元程序的調控關系，發(fā)現元程序1中的VEGFA和元程序2的CRYAB都受到這四個TFs的調控。

Fig.4 解析ccRCC內的惡性轉錄程序

 

⏩ ccRCC中CD8+T細胞聚類分析

CD8+T淋巴細胞在抑制腫瘤發(fā)展中起關鍵作用。為了闡明腫瘤浸潤性CD8+T細胞的異質性，研究者從單細胞轉錄組數據中鑒定到4個CD8+T細胞亞群，單細胞ATAC測序數據中鑒定到5個CD8+T細胞亞群。其中，耗竭亞群的細胞毒性、耗竭性和終末分化特性最強。組織駐留C1亞群的耗竭性祖細胞特征分數最高，而終末耗竭特征分數最低，說明這個亞群在腫瘤免疫治療中可能有重要作用。兩個組織駐留亞群中的C1與炎癥反應顯著相關，而C2富集細胞因子和微生素代謝途徑。在TCGA-KIRC隊列和CheckMate-025（抗PD-1治療的隨機III期試驗）隊列發(fā)現耗竭亞群中DEGs的平均表達水平與較差的總體生存率相關。與CD8+T細胞耗竭有關的調控元件：EOMES 和BATF，高度富集于耗竭亞群中，多個Rel/NF-κB 家族的 TFs也富集在耗竭亞群中。有趣的是，兩個耗竭即刻早期基因（IEG）細胞亞群受到不同TFs的調控。

Fig.5 ccRCC內CD8+T細胞的特征

 

⏩ccRCC中巨噬細胞聚類分析

腫瘤相關巨噬細胞（TAM）是腫瘤中主要的髓細胞群，在腫瘤發(fā)生和耐藥性中起重要作用。為了闡明TAM的異質性，研究者從單細胞轉錄組數據中鑒定到3個TAM細胞亞群，單細胞ATAC測序數據中鑒定到3個TAM細胞亞群。在單細胞轉錄組得到的分群中，TAM-RGCC亞群的M1特征分數最高，其次是TAM-C1QB亞群，而TAM-LGALS3的M2特征分數最高。TAM-RGCC亞群具有較高的血管生成特征分數，而TAM-C1QB亞群具有最高的吞噬作用特征分數。此外，研究者確認了免疫檢查點基因和共刺激分子的表達情況。影響T細胞免疫檢查點的配體基因在TAM-C1QB亞群高度表達，而LGALS9在TAM-LGALS3特異性表達。研究者還發(fā)現三個TAM亞群具有不同的TF調控程序，其中有四個TFs的基因活性和表達水平在對應的亞群中均大幅增加。其中MEF2C在促進M1巨噬細胞極化和誘導巨噬細胞死亡方面起到重要作用，該TF的靶基因包括多個TFs和趨化因子，這些靶基因已被證明與巨噬細胞的吞噬和血管生成作用相關。在TCGA-KIRC和CheckMate-025兩個隊列中，這些靶基因的特征分數與更好的存活率有關。

Fig.6 ccRCC內TAMs的特征

 

⏩ccRCC微環(huán)境中的細胞通訊

使用CellPhone DB分析ccRCC微環(huán)境中的細胞通訊，研究者發(fā)現內皮細胞具有最多的配體受體互作關系對，而B細胞最少。腫瘤細胞是整個TME中關鍵的細胞類型，它們與其他細胞的互作關系在腫瘤發(fā)生過程中起重要作用。在本研究中，腫瘤細胞主要與內皮細胞、TAMs、增殖性CD8+T細胞和耗竭T細胞相互作用。巨噬細胞遷移抑制因子（MIF）及其配體互作是腫瘤細胞和TAM三個細胞亞群之間較強的相互作用。研究者還發(fā)現了在ccRCC中尚未報道的新互作關系，如RPS19和C5AR1（在乳腺癌和卵巢癌TME中起到免疫抑制作用）。在TCGA-KIRC隊列中，這兩個基因平均表達水平高的患者預后差。在腫瘤細胞與三種淋巴細胞亞群的互作關系中，研究者鑒定到Treg—腫瘤細胞特異性互作關系：LTB-LTBR，這是纖維肉瘤和肝細胞癌形成的必要因素。這兩個基因平均表達水平高也與較差的預后相關。

Fig.7 腫瘤和免疫細胞間的配體受體互作關系

 

結果總結

本研究利用單細胞轉錄組和單細胞ATAC測序技術繪制了ccRCC的轉錄和表觀基因組圖譜，確定了四個介導腫瘤細胞特異性調控程序的關鍵TFs（HOXC5、VENTX、ISL1和OTP），它們具有預后意義。接下來，研究者聯合分析了CD8+T細胞和巨噬細胞亞群的染色質可及性和基因表達模式，發(fā)現了這些細胞亞群中不同的調控元件。此外，研究者還描述了TME中配體-受體相互作用所介導的細胞間通訊。綜上所述，這種單細胞多組學方法進一步闡明了ccRCC的細胞異質性，并確定潛在的治療靶點。