CAR-T細胞療法的關鍵：CAR分子的結構與設計

一、前言
CAR-T 細胞療法（Chimeric Antigen Receptor T-Cell immunotherapy）即：嵌合抗原受體T細胞免疫療法，是指通過向T細胞中導入一種人工設計的CAR分子，賦予T細胞靶向功能，再將這種改造后的CAR-T細胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)進行治療。CAR-T細胞殺傷腫瘤細胞機制不具有MHC限制性，通過結合靶向抗原即可被活化，從而高效殺傷腫瘤細胞。CAR是一種的人工改造的受體分子，它可以賦予免疫細胞被某個特定靶點激活的特異性，從而增強細胞識別抗原信號與活化的功能。

因此，CAR分子的設計是CAR-T細胞療法的關鍵環(huán)節(jié)。盡管CAR-T細胞療法在血液瘤中取得了空前成功，但依舊面臨一些挑戰(zhàn)，例如在CAR分子設計和細胞功能的改進等方面仍有很大的空間。

二、CAR分子的基本結構
CAR分子包括三個主要部分：胞外域、跨膜域和胞內(nèi)域（圖1）。胞外域中的抗原結合域通常是一個抗體來源的單鏈片段scFv分子，主要由抗體的可變輕鏈（V_L）和可變重鏈（V_H）及中間的Linker區(qū)連接組成，再通過鉸鏈區(qū)（Hinge）連接到跨膜結構域，負責識別抗原。跨膜域的主要功能在于將CAR分子錨定在細胞膜上，其對CAR分子表達的穩(wěn)定性具有重要作用。胞內(nèi)域則包括共刺激結構域和信號轉導結構域，二者合力負責T細胞的完全活化。
 

圖1 CAR分子結構示意圖
 

以下將對CAR分子的各個部分逐一介紹。

1.胞外域
抗原結合域——scFv
scFv靶向腫瘤抗原的特異性及親和力是CAR-T療法安全有效性的基礎。腫瘤相關抗原（TAA）是免疫治療的主要靶點，在腫瘤組織中高度表達，在健康組織中也有較低水平表達。這會形成對非腫瘤組織的脫靶損傷（On-target, Off-tumor），有時還會產(chǎn)生危及生命的毒性。因此，用于CAR分子設計的scFv的特異性至關重要。為了避免On-target, off-tumor副作用，抗體的特異性研究是十分重要的。

scFv的親和力特征是一個特別重要的抗原結合結構域參數(shù)，它解釋了多種受體－配體相互作用，從根本上決定了CAR分子的功能。為了識別腫瘤細胞上的抗原，誘導CAR信號傳導并激活T細胞，CAR分子的抗原結合親和力必須適中，一方面親和力要足夠誘導T細胞的活化和對腫瘤細胞的殺傷作用，另一方面親和力又不能高到對有抗原低表達的組織產(chǎn)生毒性以及過度激活導致的自身耗竭和死亡。此外，為了優(yōu)化CAR分子與其靶抗原的結合，必須考慮其他因素，例如表位位置、靶細胞上的配體密度以及單個配體結合域的親和力等。

除了簡單地識別和結合目標表位外，scFv的其他特征也會影響CAR功能。例如，V_H和V_L兩條鏈之間的相互作用方式以及互補決定區(qū)的相對位置都會影響CAR分子對其目標表位的親和力和特異性。而目標表位的結構、空間可用性和功能方面也需要考慮在CAR分子的設計中。

最后，免疫原性也是必須考慮的因素。利用雜交瘤技術制備的鼠源單克隆抗體（mAb）具有較強的免疫原性，可被人體免疫系統(tǒng)視為抗原，觸發(fā)免疫系統(tǒng)介導的排斥反應，甚至引發(fā)嚴重的免疫疾病。因此，scFv的人源化有助于提高CAR-T細胞的安全性和治療潛力。

總結來說，scFv的親和力、特異性、目標表位和免疫原性這四個特征對于CAR-T分子的設計至關重要。

鉸鏈區(qū)——Hinge
鉸鏈或間隔區(qū)由CAR分子的非抗原結合細胞外區(qū)域組成。鉸鏈區(qū)的功能是提供克服空間障礙的靈活性，允許抗原結合域進入目標表位。鉸鏈區(qū)的長度和組成的差異會影響CAR分子的表達、柔韌性，以及信號傳導、表位識別等，最終影響CAR分子的功能。因此，必須針對每個特定的抗原結合域進行量身定制，從而確定最佳的鉸鏈區(qū)結構。

2.跨膜域
跨膜結構域負責將CAR分子的細胞外結構域與細胞內(nèi)結構域連接起來，從而將配體識別信號轉導至細胞內(nèi)。由于跨膜域經(jīng)常根據(jù)細胞外間隔區(qū)或細胞內(nèi)信號傳導域的要求而變化，因此在設計CAR分子時必須考慮到這些因素。

3.胞內(nèi)域
共刺激結構域
CAR分子中的共刺激結構域負責給T細胞提供第二個激活信號。最常見的共刺激域是CD28和4-1BB，CD28共刺激因子可誘導更強烈的急性反應，但其作用持久性有限；而4-1BB因子的激活能力較低，卻具有較高的長期持久性。

信號轉導結構域
T細胞受體（TCR）在細胞內(nèi)與CD3二聚體密切相關，后者攜帶基于免疫受體酪氨酸的激活基序（ITAM），ITAM在被淋巴細胞特異性蛋白質酪氨酸激酶（LCK）磷酸化后啟動T細胞激活信號。多年來，CD3ζ鏈已被用作標準的CAR分子信號轉導結構域，而ITAM的數(shù)量及位置等因素也可為CAR分子的設計提供信息。

三、迭代進化中的CAR分子
根據(jù)胞內(nèi)結構域設計的不同以及引入細胞因子和配體的差異，CAR分子目前可分為五個不同的代次（圖2）：
 

圖2 CAR分子的迭代^[1,2]

1.第一代CAR
上世紀八十年代末，Zelig Eshhar團隊^[3]大膽地將抗體scFv與CD3ζ直接融合成一個蛋白質，且證明表達這樣融合蛋白的T細胞能傳導信號、分泌白細胞介素并在體外殺死表達特定抗原的淋巴瘤細胞，至此第一代CAR-T產(chǎn)生。由于沒有共刺激域，第一代CAR-T的信號傳導效率低下，并且體內(nèi)增殖能力較弱、存活時間都較短，最終未能在臨床應用中獲得預期的療效。

2.第二代CAR
科學家在第一代CAR-T的基礎上引入了一個共刺激域（CD28或4-1BB），增強了T細胞對活化信號的響應能力，并且在臨床治療中展現(xiàn)了令人驚喜的治療效果。目前上市的CAR-T藥物均為二代產(chǎn)品，如Kymriah和Yescarta等。

3.第三代CAR
第三代CAR-T在第二代的基礎上引入了兩個共刺激域（CD28和4-1BB），以期望達到更好的信號傳導的效果。然而共刺激信號不是簡單的相加，增加多個共刺激因子也可能因為改變CAR-T胞內(nèi)段結構域的長度而導致原有的信號減弱或不能傳遞。因此這種方法提供的臨床益處仍存在爭議。

4.第四代CAR
為了增強CAR-T細胞的功能，第四代CAR-T引入了一個細胞內(nèi)結構域共表達一些小分子物質（如促炎癥細胞因子IL-12），能夠觸發(fā)由細胞因子誘導的信號或者阻斷影響CAR-T細胞功能的一些信號通路，以期收獲更強的療效。

5.第五代CAR
第五代CAR-T即通用型CAR-T，是指從健康志愿者獲取T細胞并進行基因編輯敲除相關基因，然后轉入CAR基因制成的CAR-T細胞，最主要的優(yōu)勢在于不需要從患者體內(nèi)獲取T細胞進行定制，而是可以做到現(xiàn)貨供應，從而節(jié)約時間和治療花費。

四、總結
CAR分子結構的每個模塊都獨立并協(xié)同地影響CAR-T細胞的功能。一般來說，嘗試在scFv和共刺激分子方面進行改造是CAR分子設計和優(yōu)化的切入點。除了以上提到的五代CAR以外，還有其他基于不同目的的新穎CAR分子也被設計出來，例如針對抗原丟失的雙價串聯(lián)CAR、特異性識別健康組織的抑制性CAR、攜帶自殺基因以提高安全性的CAR等等。然而，也有研究證明鉸鏈區(qū)和跨膜域可能是CAR分子設計的重要潛在組成部分，對于改善基于CAR的抗腫瘤功能至關重要。由于CAR分子的設計環(huán)節(jié)涉及到多個組分，使得CAR優(yōu)化過程難以測試，因此必須進行系統(tǒng)的評估和考量，為合理設計下一代CAR-T細胞指明方向。

參考文獻：
[1] Mchayleh, W.; Bedi, P.; Sehgal, R.; Solh, M. Chimeric Antigen Receptor T-Cells: The Future Is Now. J. Clin. Med. 2019, 8, 207.

[2] Hughes-Parry Hannah E., Cross Ryan S., Jenkins Misty R.(2019). The Evolving Protein Engineering in the Design of Chimeric Antigen Receptor T Cells. Int J Mol Sci, 21(1), undefined. doi:10.3390/ijms21010204

[3] Eshhar, Z., Waks, T., Gross, G. and Schindler, D. G., Specific activation and targeting of cytotoxic lymphocytes through chimeric single chains consisting of antibody-binding domains and the gamma or zeta subunits of the immunoglobulin and T-cell receptors. Proc Natl Acad Sci USA 1993. 90: 720–724.