詳解PCR的三個(gè)步驟

PCR又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，PCR的過程可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)，是能將微量的DNA大幅增加。

1、PCR的三個(gè)步驟：
1). 高溫變性: 利用DNA在體外攝氏95°高溫時(shí)變性會(huì)變成單鏈；
2). 低溫退火: 低溫（經(jīng)常是60°C左右）時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合；
3). 中溫延伸: 當(dāng)調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補(bǔ)鏈。
                 
基于聚合酶制造的PCR儀實(shí)際就是一個(gè)溫控設(shè)備，能在變性溫度，復(fù)性溫度，延伸溫度之間很好地進(jìn)行控制。它需要DNA模板，上下游引物，taqDNA聚合酶，dNTP以及緩沖液(鎂離子很重要)，當(dāng)然還有超純水。
當(dāng)然現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室做PCR，買的緩沖液里面是直接加好聚合酶和dNTP的，可以直接用。
一般的25微升體系里DNA模板和上下游引物各1微升，PCR MIX12.5微升，ddH2O9.5微升。

三步法：
第一步：94℃變性30s；
第二步（循環(huán)30-35次）：94℃變性30s，55-60℃退火30s，72℃延伸24s（時(shí)間按照合成速度和長(zhǎng)度來計(jì)算）；
第三步：72℃終止延伸5-10min。

2. 引物
引物設(shè)計(jì)步驟：
找到目的基因的CDs序列（存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄本時(shí)可對(duì)各個(gè)轉(zhuǎn)錄本的保守區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)）；用軟件設(shè)計(jì)和評(píng)價(jià)引物（Oligo軟件）；blast引物特異性。

要求：
引物長(zhǎng)度為15-30bp，最常用的為23bp；引物Tm值介于62-73℃之間，上下游引物Tm最好相近以保證其能高效工作；3’-端的Tm值要低于5’端；引物GC含量約為40-60%；避免擴(kuò)增模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)域；避免引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)；避免與靶DNA錯(cuò)配。

3. PCR酶：可按需要選擇普通的Taq酶、可擴(kuò)增長(zhǎng)片段的Taq酶或高保真酶。

4. PCR體系：按所選的PCR酶說明書來配制。

5. PCR產(chǎn)物檢測(cè)：一般采用瓊脂糖凝膠電泳，必要時(shí)也可使用聚丙烯酰胺凝膠電泳。

6、反轉(zhuǎn)錄引物選擇：
1. Oligo dT：適用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT要結(jié)合到PolyA尾巴上，所以對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，即使有少量降解也會(huì)使全長(zhǎng)cDNA合成量大大減少。
2. 隨機(jī)引物（random primer）: 適用于長(zhǎng)的或具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNA。適用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
3. 特異性引物（Specific primer）:與模板序列互補(bǔ)的引物，適用于目的序列已知的情況。