光纖記錄技術(shù)深度解析，揭開拓展實(shí)驗研究的奧秘

光纖記錄（Fiber photometry）通過時間相關(guān)單光子計數(shù)(TCSPC)的光纖光學(xué)來測量熒光分子在大腦中發(fā)出的光信號。基于基本原理，使用直徑較小的光纖探頭就能實(shí)現(xiàn)傳輸并收集熒光信號，將采集到的發(fā)射信號通過二色鏡進(jìn)行光譜分離，并通過濾波器聚焦到探測器上，即可檢測出熒光的實(shí)時動態(tài)變化。
 

 所以光纖記錄方法的優(yōu)勢主要在于：

1. 植入的光纖探頭體積小且柔韌性好，使得周圍組織損傷較��；
2. 因為植入光纖體積小，方便同時記錄多個大腦區(qū)域的信號；
3. 基于TCSPC的光纖是檢測發(fā)射光的超靈敏工具，滿足在低強(qiáng)度激發(fā)光下即可檢測熒光，從而減少了光漂白的機(jī)會，并延長了記錄時間。

目前光纖記錄常用于檢測鈣信號及神經(jīng)遞質(zhì)信號變化，背后原理是通過給實(shí)驗動物注射基因編碼型的熒光探針/生物傳感器，隨后通過光纖記錄即可檢測到對應(yīng)神經(jīng)信號的變化。基因編碼生物傳感器是一類生物分子信號介質(zhì)，它被整合到細(xì)胞的基因組中，然后由細(xì)胞的分子機(jī)制產(chǎn)生。這些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可以被設(shè)計成在化學(xué)物質(zhì)存在或細(xì)胞環(huán)境變化時改變構(gòu)象，從而產(chǎn)生熒光信號。

常見的基因編碼型的生物傳感器根據(jù)應(yīng)用場景主要分為：

 

1、膜去極化。一旦動作電位(AP)被激活，AP將沿軸突向下傳播，并使突觸前鈕扣對應(yīng)的膜去極化(從−65 mV到+40 mV或更大)。這種膜去極化作為神經(jīng)元激活的分子特征，可以通過遺傳編碼的電壓指示探針(GEVIs)檢測；

2、電壓門控Ca2+通道激活和輸入。當(dāng)膜去極化發(fā)生在突觸前活躍區(qū)，電壓門控Ca2+通道打開，導(dǎo)致Ca2+快速內(nèi)流。這種升高的細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度(從~100-~400nM)的變化可以持續(xù)約50-150毫秒，通過基因編碼Ca2+指示劑(GECIs)即可檢測；

3、膜泡融合/胞外分泌。胞質(zhì)Ca2+水平升高觸發(fā)易于釋放的突觸囊泡的胞外排泄，這些突觸囊泡充滿了神經(jīng)遞質(zhì)。在胞外分泌過程中，當(dāng)突觸囊泡與質(zhì)膜融合時，細(xì)胞外介質(zhì)(pH ~ 7.4)中和囊泡腔(pH ~ 5.5)的酸性pH值，這種中和作用可以通過pH值指標(biāo)探針檢測，如pHluorin；

4、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞。一旦神經(jīng)遞質(zhì)被釋放到突觸，它們的功能根據(jù)遞質(zhì)類型而異，可以通過神經(jīng)遞質(zhì)(NT)指標(biāo)檢測，如iAChSnFR和 dLight。基因編碼型乙酰膽堿(ACh)探針iAChSnFR用于檢測不同生物樣品中的ACh瞬變。它被設(shè)計成在膽堿結(jié)合時發(fā)出熒光，并被證實(shí)可用于測量小鼠體內(nèi)獎勵活動中海馬ACh傳遞的反應(yīng)。dLight是一種基于受體的遺傳編碼多巴胺(DA)熒光探針。它是通過用環(huán)狀排列的綠色熒光蛋白(cpGFP)取代DA受體(DAR)的第三個胞內(nèi)環(huán)（Intracellular Loop 3，ICL3）的位置而構(gòu)建的。dLight產(chǎn)生不同的熒光強(qiáng)度對應(yīng)于DA與DAR的結(jié)合量。
 

圖1所示：光纖記錄系統(tǒng)原理和基因編碼熒光探針。

A.光纖記錄裝置和信號處理的原理圖。在該模型中，將基因編碼的熒光探針病毒注射到腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)，投射的信號從伏隔核(NAc)和前額皮質(zhì)(PFC)記錄下來。

B.四種不同的基因編碼型探針及其對應(yīng)的神經(jīng)傳遞分子信號的示意圖表示。隨著動作電位(AP)的傳播，電壓門控鈣(Ca2+)通道被觸發(fā)打開，導(dǎo)致快速的Ca2+內(nèi)流；隨即誘導(dǎo)突觸囊泡的胞吐，突觸囊泡將神經(jīng)遞質(zhì)(NTs)釋放到突觸間隙，在突觸間隙中神經(jīng)遞質(zhì)可以與相應(yīng)的受體結(jié)合并激活突觸后神經(jīng)元，這些分子特征可以通過電壓指標(biāo)(GEVIs) ，Ca2+探針(GECIs)， pH值指標(biāo)探針(如pHluorin)，NT指標(biāo)探針(G protein-coupled受體,GCPR)進(jìn)行檢測。示意圖非真實(shí)比例。

光纖記錄實(shí)驗操作較為簡便，目前在神經(jīng)環(huán)路分子機(jī)制探究上應(yīng)用越發(fā)廣泛，同時越來越多的實(shí)驗室將光纖記錄與其他實(shí)驗技術(shù)進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用。

1、光纖記錄與光遺傳
光遺傳學(xué)是一種以光作為工具特異性激活或抑制神經(jīng)傳遞的方法。研究人員經(jīng)常使用光遺傳學(xué)以極大的時間精確度來研究確定的神經(jīng)元亞群對特定行為的影響。但是光照的作用僅僅通過動物行為的檢測評估是不完善的，很有可能存在“假陽性”和“假陰性”，且不能排除自然行為的干擾。而光纖記錄即可提供足夠的證據(jù)支撐。光遺傳學(xué)結(jié)合光纖記錄的方法使研究人員能夠研究特定細(xì)胞、它們的投射關(guān)系的功能意義。

2、光纖記錄與核磁
一般認(rèn)為，血氧水平檢測(BOLD) fMRI(功能性磁共振成像)通過血管耦合機(jī)制與神經(jīng)傳遞在時空上相關(guān)。為了更深入地了解神經(jīng)元對BOLD信號的貢獻(xiàn)，電生理學(xué)技術(shù)已被納入功能磁共振成像研究。雖然這些研究提供了關(guān)于神經(jīng)元環(huán)路更具體的信息，但功能磁共振成像(fMRI)所需要的磁場會在電生理信號中產(chǎn)生偽影。

而近幾年的研究中將光纖記錄和fMRI相結(jié)合，證明了Ca2+峰值和不同大腦區(qū)域的BOLD信號之間的聯(lián)系，同時有文獻(xiàn)證明星形膠質(zhì)細(xì)胞Ca2+水平的變化與BOLD信號也有關(guān)聯(lián)。fMRI技術(shù)與光纖記錄相結(jié)合，使fMRI掃描具有細(xì)胞分辨率。這種綜合技術(shù)有潛力闡明單個神經(jīng)元亞群對大腦回路的貢獻(xiàn)。
 

圖2所示：將BOLD fMRI技術(shù)與細(xì)胞-特異性病毒傳遞的GCaMP6（一種遺傳編碼的鈣指示劑，GECI）的光學(xué)檢測技術(shù)相結(jié)合（Schlegel et al .,Nature protocols(2018)）

3、光纖記錄與電生理
目前，電生理學(xué)是研究行為與自由行為動物體內(nèi)神經(jīng)元動力學(xué)關(guān)系的金標(biāo)準(zhǔn)分析技術(shù)。電生理學(xué)允許同時記錄數(shù)百或數(shù)千個細(xì)胞、離子通道和神經(jīng)元活動，電極可以落在單個細(xì)胞上，記錄細(xì)胞內(nèi)信號變化，或者落在細(xì)胞外空間，監(jiān)測整個大腦區(qū)域的電生理信號。它測量的電信號（電流或電位）以高時間分辨率的毫秒級離子通量導(dǎo)出。

電極陣列記錄來自電極尖端附近所有細(xì)胞的信號，不能直接區(qū)分細(xì)胞種類。由于光纖記錄方法缺乏較高的時間分辨率，在體電生理學(xué)缺乏細(xì)胞類型特異性，二者結(jié)合有助于高時空分辨率下研究不同的大腦區(qū)域特定環(huán)路和行為狀態(tài)。
 

R820三色光纖記錄系統(tǒng)，可記錄GCaMP、dLight等綠色熒光指示劑或遞質(zhì)探針，及RCaMP、jrGECO1a等紅色指示劑或遞質(zhì)探針信號，同時特有的410nm光源用于獲取對照信號，有效排除噪聲。靈活的TTL信號輸入輸出設(shè)置，更方便拓展實(shí)驗應(yīng)用。