ddPCR與qPCR在銀鯧魚的種屬鑒定與定量研究方面的比較

銀鯧魚的種屬鑒定與定量研究
Species identification and quantfication of silver pomfret using the droplet digital PCR assay

 
背景
 
銀鯧魚（Pampus argenteus）是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的物種，中國有巨大的市場需求。近年來，由于高強(qiáng)度的捕撈，銀鯧魚的數(shù)量有所下降，為了維持利潤，一些制造商已經(jīng)采取了用更便宜的魚代替銀鯧魚，進(jìn)行食品的造假、摻假。

目的

開發(fā)一種準(zhǔn)確的方法來識別銀鯧魚食品，減少食品造假、摻假的非法行為。

實(shí)驗(yàn)材料

銀鯧魚和金鯧魚， 兩種魚按照比例分別為0.1%、0.5%、1%、10% 和50% 進(jìn)行混合， 即混合物中含有0.1g銀鯧魚/99.9g金鯧魚、0.5g銀鯧魚/99.5g金鯧魚、1g銀鯧魚/99g金鯧魚、10g銀鯧魚/90g金鯧魚，還有50克銀鯧魚/50克金鯧魚。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

①篩選ddPCR引物和探針；
②特異性測試；
③引物和探針之間濃度比篩選；
④熔融溫度篩選；
⑤PCR循環(huán)數(shù)篩選；
⑥qPCR對比測試。

 
CY-1 細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ亞基（COI） CY-2 細(xì)胞色素B（cytb）
CY-3 16srrna
對三組引探進(jìn)行測試，CY-2、CY-3無擴(kuò)增產(chǎn)物，故本實(shí)驗(yàn)采用CY-1組引探。
 
2，特異性測試

 
銀鯧魚液滴數(shù)字PCR檢測的特異性檢驗(yàn)。{ 樣品說明如下： PC， 陽性對照（ 銀鯧魚）；NC， 陰性對照（ 無菌蒸餾水）；1，卵狀細(xì)鱗鯛；2，無節(jié)圓鰓鯛；3，點(diǎn)狀圓鰓鯛；4，圓頭鯛；5，中國對蝦；6，灰鯛。
 
3，引物和探針之間濃度比篩選

不同的引物與探針濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對比，最終選取了300：200、300：300、400：200三種濃度比進(jìn)行下一步測試。
 
 
4，熔融溫度篩選

對實(shí)驗(yàn)③的三種不同濃度的探針進(jìn)行TM篩選，最終選定56℃、57℃、58.2℃三個溫度來進(jìn)行下一步測試。
 
 
5，PCR循環(huán)數(shù)篩選

對實(shí)驗(yàn)④的三個溫度進(jìn)行循環(huán)數(shù)篩選。
 

 

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永諾醫(yī)療是永諾生物的全資子公司，以“中國智造”為己任，專注于數(shù)字PCR儀器與應(yīng)用試劑的研發(fā)，并于2017年成功研發(fā)了國內(nèi)首款擁有完全自主知識產(chǎn)權(quán)的MicroDrop®系列微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)并投入生產(chǎn)。