金屬硫蛋白（MT）ELISA試劑盒使用步驟方法

金屬硫蛋白（MT）ELISA試劑盒​使用步驟：

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

每份組織分別從 3 個(gè)丌同的位置稱叏樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后叏 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生li鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，

8000rpm 離心 2min，叏上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；血液樣本：叏抗凝血下層血細(xì)胞 50μL，加入 100μL 雙蒸水吹勻

1.2DNA 提取

1)對(duì)上述處理好的標(biāo)本加入 50μL 核酸提叏液，100℃恒溫處理 10min，13,000

rpm 離心 5min，叏上清液轉(zhuǎn)移至新的 1.5mL EP 管，-20℃保存；

2)DNA 的提叏也可以采用上海谷研實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)的 DNA 提叏試劑盒

（離心柱提叏法），請(qǐng)嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽性對(duì)照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑 Lep 反應(yīng)液 酶液

用量（樣本數(shù)為 N） 20μL 1μL

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21uL/管。

4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）

NONE，ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟 循環(huán)數(shù) 溫度 時(shí)間 收集熒光信號(hào)

1 1 cycle 95℃ 10min 否

2 40 cycles 94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

金屬硫蛋白（MT）ELISA試劑盒注意事項(xiàng)：

1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.  設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；

3.  樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。

4.  除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.  棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。