模擬細胞外基質(zhì)的纖連蛋白-透明質(zhì)酸基光固化水凝膠

機械信號會誘導細胞的各種下游效應，包括對干細胞行為的調(diào)節(jié)。細胞活動軌跡在機械和化學性能可以精準調(diào)整的生物材料基質(zhì)上具有典型的特征；然而，這些基質(zhì)中的大多數(shù)都不能體現(xiàn)細胞外基質(zhì)（ECM）的生物復雜性。針對上述問題，來自英國格拉斯哥大學的ManuelSalmeron-Sanchez教授團隊在Advanced Healthcare Materials上發(fā)表了題為“Engineered Full-Length Fibronectin–Hyaluronic Acid Hydrogels for Stem Cell Engineering”的研究性論文。作者使用ECM的兩個主要的組成部分，透明質(zhì)酸（HA）和纖連蛋白（FN）構(gòu)建水凝膠體系用于機械生物學研究。與典型的FN表面化學吸附不同，該體系包含了與HA共價交聯(lián)的全長度FN。無論是水凝膠表面還是內(nèi)部，都表現(xiàn)出獨立于FN濃度和活細胞培養(yǎng)能力的水凝膠力學性能的控制。


首先，作者使用硫醇化方法制備出一種可結(jié)合ECM組成部分的水凝膠。用降冰片烯對HA進行修飾，形成降冰片烯修飾的HA （NorHA）。根據(jù)核磁共振（1H NMR）分析，合成的NorHA大約有20%的降冰片烯功能化的單元結(jié)構(gòu)。最終，作者設計合成了一種具有可控制交聯(lián)密度和降解性的光學透明FN-HA水凝膠（圖1）。
 

圖1 全長FN-HA水凝膠的制備

為了評估FN在水凝膠中的摻入情況，作者使用化學展開的FN（即使用TCEP暴露硫醇基團）或天然的FN（即不暴露硫醇基團）制備HA水凝膠。水凝膠標記為HA XFN，其中X為加入到水凝膠中的FN濃度，單位為每毫升微克。形成水凝膠后，作者進行了一系列清洗，以去除水凝膠中未交聯(lián)的蛋白，然后用免疫染色觀察剩余的FN。同時與作者預期的一樣，在僅含HA的水凝膠的對照組中未檢測到FN（圖2）。


圖2 力學性能可控的FN-HA水凝膠檢測


作者將人骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）接種于含有不同數(shù)量FN的FN-HA水凝膠上，在不含F(xiàn)N的HA表面的MSCs表現(xiàn)為微小擴散，呈彌漫性肌動蛋白染色，形態(tài)圓形。作者只在接種于HA 500FN上的細胞中檢測到FAs，這一發(fā)現(xiàn)表明了HA在細胞初始粘附中的重要作用，提供了與整合素無關(guān)的HA 0FN和HA 50FN上的早期細胞附著。正如預期的那樣，由于HA沒有上沒有整合素的受體，因此在HA 0FN上的細胞中不會形成FA（圖3）。


圖3 間充質(zhì)干細胞附著并散布在FN-HA水凝膠


為了研究HA在MSC上附著中的作用，作者進行了早期附著研究（3 h）來觀察細胞表面受體CD44，它是細胞結(jié)合HA的主要蛋白之一。作者發(fā)現(xiàn)，與FN-HA水凝膠相比，接種在HA 0FN上的細胞產(chǎn)生了更大的CD44簇（通過簇面積測量），并且當CD44簇面積按細胞大小標準化時，這些差異更加明顯。這一正�；�是重要的，因為與FN水凝膠相比，HA 0FN水凝膠上的細胞明顯更小。


圖4 HA對MSC通過CD44連接和擴散的影響


YAP已成為細胞對局部機械特性反應的重要標志，起著機械變阻器的作用。YAP/TAZ被認為是機械轉(zhuǎn)導的主要調(diào)節(jié)因子，在將外部機械信號（如ECM剛度）轉(zhuǎn)譯到細胞核和啟動通過細胞核的下游信號傳導中起著至關(guān)重要的作用。圖5顯示了接種在HA FN水凝膠上的MSCs的YAP的易位。僅擴散的HA 0FN水凝膠（no FN）中，YAP染色存在于間充質(zhì)干細胞中，且主要定位于細胞質(zhì)，而接種于含F(xiàn)N水凝膠（即HA 50FN和HA 500FN水凝膠）上的細胞則呈現(xiàn)細胞質(zhì)和細胞核均有YAP染色。


圖5 在相同的水凝膠硬度下，隨著FN數(shù)量的增加，YAP進入細胞核的易位增加


在對這種新的水凝膠體系進行初步表征后，作者測試了MSCs在包封后是否存活。MSC存活率等于或大于80%，顯示高細胞相容性。結(jié)果證實了紫外光觸發(fā)巰基反應對3D細胞培養(yǎng)以及FN交聯(lián)時的適用性。作者還研究了7天后三維細胞的擴散和YAP易位，盡管在添加和不添加FN條件下，F(xiàn)N-HA水凝膠的縱橫比相似，但細胞內(nèi)的細胞面積更大。以上結(jié)果表明，巰基經(jīng)UV引發(fā)的光交聯(lián)封裝后的MSCs存活率表明，該系統(tǒng)可以原位封裝細胞和細胞擴散，也證明了其作為三維微環(huán)境的適用性。


圖6 經(jīng)FN-HA水凝膠包封的間充質(zhì)干細胞具有較高的生存能力

 
在本研究中，作者展示了一種通過合成降冰片烯功能化的新方法，將全長FN納入天然HA水凝膠并利用它在UV觸發(fā)的巰基雙鍵交聯(lián)過程中直接共價結(jié)合FN。這些水凝膠被制造包含不同數(shù)量的FN。力學性能是獨立于FN含量控制的，MSC分別通過CD44與整合素之間的結(jié)合對HA和FN做出反應。這些水凝膠可以用于MSC的3D包封和擴散。該材料是一種多功能系統(tǒng)，可作為干細胞2D和3D工程基礎(chǔ)研究的平臺。