阿爾茨海默病學習記憶相關行為學疑問的解答匯總
7月23日晚上七點，賽業(yè)生物云課堂開展了主題為“阿爾茨海默病學習記憶相關行為實驗概述”的課程，需要課件的老師可以關注“賽業(yè)生物訂閱號”，后臺留言“006”。針對答疑環(huán)節(jié)未及時解答的問題，我們進行了收集整理，下文為黃穎博士針對答疑環(huán)節(jié)提出的問題給出的詳細解答。
Q1: 行為學表現與預期不同時的處理方法？
A: 我不知道您說的預期是指陽性對照和陰性對照之間沒有檢測出差異，還是處理組差異，我先假設您陽性對照和陰性對照是有差異的，造成檢測組沒有差異的可能無非有5種：①本來處理組就沒有明顯作用（這個需要文獻或者是把實驗做到極致才能確定）；②N不夠，沒有統(tǒng)計差異（加N）；③實驗難度過高，造成地板效應（降低難度，如縮短訓練和檢測之間的時間等）；④實驗難度過低，造成地板效應（提高實驗難度）；⑤組內變異太大（小鼠年齡，性別等的統(tǒng)一）。
Q2: 水迷宮實驗時要提前對動物進行初篩，排除異常行為或視力的動物嗎？
A: 年輕的動物一般可以不用初篩，而年老（12個月以上）則需要對動物的視力和異常行為進行檢測。不過一方面平臺可見期的實驗除了對動物進行運動能力和視力的檢測以外，還有幫助小鼠確定水池中有逃生平臺，幫助其下水后盡早確立行動目標，所以個人認為最好提前做。
Q3: 造模中動物的死亡問題？
A: 這個問題我理解為行為實驗時動物的死亡。這主要涉及動物的年齡和轉入/編輯基因的狀態(tài)，水迷宮實驗要特別注意水溫以及游泳完成后小鼠的保溫，如果是電刺激相關的實驗，需要降低電刺激持續(xù)的時間�；蚓庉媱游镄枰⒁馕墨I中報道的小鼠生存曲線。
Q4: 常用模型都有哪些，可以做什么行為學實驗？評價指標是什么？
A: AD四大模型：Tg2576，APPPS1△E9，5×FAD，3×Tg。
主流行為實驗包括：水迷宮，新物體識別，Y/T迷宮，巴恩斯迷宮，放射迷宮，恐懼記憶箱。AD還會做一些情緒相關實驗，如礦場，高架迷宮等。
Q5: 在行為學實驗中通常使用什么行為實驗，各有什么優(yōu)缺點，和實驗的注意事項？
A: 1. 水迷宮
優(yōu)點：驅動力強，可獲得數據多，不用每次換小鼠清洗設備，認可度高；缺點：小鼠應激性較強，設備搭建和數據分析要求較高，年老小鼠容易中途死亡。
2. 新物體識別
優(yōu)點：設備搭建相對簡單，可獲得數據較多，小鼠應激性��；缺點：物體選擇需要謹慎，驅動力較弱，易受環(huán)境影響。
3. Y迷宮
優(yōu)點：設備搭建簡單，實驗種類較多，小鼠應激性小老少咸宜（非饑餓驅動）；缺點：清洗麻煩，隨機性較大。
注意事項請關注賽業(yè)生物公眾號，我以后會在推文里進行詳細的介紹。
Q6: 阿爾茨海默病動物模型的建立及判斷成功建立的標準？
A: 最高標準：分子（Aβ沉淀和NTF），細胞（易感區(qū)域神經元死亡，突觸丟失），組織（腦容量減少），電生理（突觸可塑性改變），行為（記憶認知減退）。前4個項目中任意兩種加上行為改變就算成功了，當然你也可以對自己提出更高的要求。
Q7: 水迷宮實驗的結果如何統(tǒng)計分析？
A: 具體可參考Nature Protocol，里面有很詳細的說明《Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory》。
Q8: 新物體識別y迷宮行為學實驗注意的問題？
A: 具體可參考《The Y-Maze for Assessment of Spatial Working and Reference Memory in Mice》。
Q9: 目前已有model的bug，創(chuàng)建新型model的突破點在哪？
A: 主要的bug在于是轉基因。因為以目前的眼光來看轉基因屬于比較粗糙的基因編輯技術，拷貝數不定，插入位點隨緣，啟動子過于強大，雙/多轉基因只重病理表型，對致病的根本原因重視不夠；所以，理論上而言，目前最理想的基因編輯方式應該是KI（同時避免隨機插入和過量插入），而且只能改變一個家族性AD基因（因為家族性AD中沒有同時APP和PS1發(fā)生突變的），啟動子用人/鼠自身的啟動子（盡量使表達調控方式一致），而且除了小鼠外可以嘗試大鼠（大鼠的MAPT產物剪切方式和人類一致性高，而且比小鼠更適合行為實驗）。但是目前的問題在于KI大/小鼠表型都很弱，進而造成相關研究較少。
Q10: 不同模型的適應阿爾茲海默癥治療藥物的區(qū)別，不同行為學的統(tǒng)計分析？
A: 這是個大問題，藥物和AD模型的排列組合太多了，每種AD模型連表型都沒有完全統(tǒng)一，這個問題抱歉沒法回答。兩組比較用T-test，學習曲線比較用two-way ANOVA，具體建議可參考nature protocol或者JOVE中的詳細介紹。
Q11: 小鼠的觸屏行為也可以做AD，咋沒提到呢？
A: touch screen system是在2000年以后發(fā)明的，這次介紹的是近20年使用頻率最高的四種AD相關行為學實驗，而TCS目前在AD中的論文數量與這四種還相距甚遠，不過如果同學感興趣我們可以下次安排介紹剩余的行為學習記憶實驗方法。
Q12: 探索期是從幾號放進去的？（水迷宮最后探索期在幾號數字放下去的）
A: PPT中的方案是從平臺象限正對的位置放入（這個位置在訓練期是沒有用過的），不過我講的方法只是我自己認為比較好的水迷宮流程，目前也有其他的小鼠入水方案。
Q13: 周齡對行為學結果的影響？
A: 性成熟后兩周開始，小鼠身體各個方面進入最佳狀態(tài)，這個期間小鼠均一性好，年齡越大除了運動和認知能力整體減弱以外，由于生長過程中積累的變量不同，差異也變大。此外，動物實驗的每組小鼠不多，會增加組內差異。
Q14: 新物體識別小鼠探索物體的總時間15s左右需要剔除嗎？觀察時間5min？
A: 有很多實驗就是設置的15s探索時間，只要標準統(tǒng)一，15s也是常用的參數。觀察時間上限我們一般設置為5分鐘，5分鐘和10分鐘都是主流時間，不過個人覺得5分鐘就夠了，不喜歡探索的小鼠即便你多等5分鐘也意義不大。
Q15: 條恐freezing%閾值的選擇 ，及結果的分析？
A: FC是集成度最高的設備，不同的設備對應不同的軟件，很多FC設備都是自帶軟件的，所以Freezing的閾值設置也有所區(qū)別，一般都是有一個移動的范圍和持續(xù)時間作為判斷是否僵直的參考（比如小鼠在間隔為100ms的采樣頻率下，連續(xù)2s每幀畫面的移動范圍不超過5%），但是又需要通過一些算法過濾掉呼吸引起的動作，所以一般需要參考不同軟件的說明進行設置。
Q16: 同一批小鼠可以把行為學都做了嗎？
A: 可以，但是不同的行為學之間最好間隔兩周以上，同時電刺激相關會讓小鼠產生應激性的實驗應該盡量放在行為實驗的最后進行，NORT一般可以做2次，我們實驗室以前一般是在8-9月齡時做一次NORT，18-22月齡時再做一次。
Q17: App Ps1兩轉鼠Aβ和Tua出現的時間？
A: 前者6-7個月出現，沒有tau形成的NTF。
Q18: 恐懼箱的聲音刺激55Hz夠嗎？箱體風扇的白噪音都有60Hz以上？
A: 我在課程里講的是引用了2014年JOVE文章中的設置。重點是作為Cue的聲音強度要和作為背景的聲音強度有明顯區(qū)別，強度單位是db，聲音頻率的單位是Hz，這兩個意義不一樣哦。
Q19: ymate需要對每個臂標記下嗎？
A: 需要，因為嚴格的Y迷宮實驗中每個臂都要輪換著用，所以需要標記以確保每個臂都會用到。
Q20: Y迷宮可以用人工分析嗎？
A: 可以，Y迷宮相對其他行為學而言因為只有次數和時間，可以人工分析，但一定要錄視頻。
Q21: 可以在同一天做Y迷宮跟曠場實驗嗎？
A: 沒有足夠的證據說明不能，但是一般原則是不同行為學實驗最好不要在一天做。我個人的理解是如果Y迷宮不是禁食的那種，且兩個實驗加起來8小時內就能完成，沒問題，如果需要超過12個小時，時間跨度太大，對小鼠的節(jié)律有影響。
Q22: 新物體識別，分析怎么取數據？
A: 具體可參考課件P22。
Q23: 新物體識別怎么分析，都自己手動計時？
A: 能用軟件就用視頻分析軟件吧，手動計時主觀性太高，嚴格來說，手動計時需要雙盲。
Q24: 水迷宮是不是需要做路徑分析？
A: 是的，雖然會多花一些時間，但路徑分析的意義在于即便小鼠在找到平臺的用時方面沒有區(qū)別，但如果路徑有區(qū)別也是能說明問題的，給自己多留條路比較好，而且Reviewer也經常會問的。
Q25: 水迷宮水溫的影響？
A: 水溫高，驅動力不夠，小鼠可能選擇漂浮；水溫低小鼠熱量喪失快，應激反應強，容易病或死。但是對于年老小鼠（16個月以上）需要參考其他文獻中的水溫設定稍微提高一點。
Q26: 請問上午下午做實驗有區(qū)別嗎？
A: 有區(qū)別，但是要看什么實驗，刺激越強的實驗區(qū)別越小。實驗盡量在8小時內完成，小鼠太多最好分批做，接近小鼠休息的時期或者小鼠剛休息完就進行實驗小鼠狀態(tài)的均一性較差（想想你自己上午和下午狀態(tài)是不是一致的）。
Q27: 能不能再講講APOE4人源化的小鼠模型，會有認知癥狀么？
A: 單獨APOE4并不會引起AD的病理表型，但也有報道說APOE4人源化小鼠有輕微的認知癥狀，不過其對照是APOE3 KI（Interaction of ApoE3 and ApoE4 isoforms with an ITM2b/BRI2 mutation linked to the Alzheimer disease-like Danish dementia: Effects on learning and memory），且大部分文章并沒有發(fā)現APOE4小鼠有認知癥狀。
Q28: 新物體識別可以間隔多久再給動物重復做？
A: 做完一個長時程和一個短時程的試驗后一般最少兩周以后才可以做，除非有什么特別的理由，物體也不要用上次實驗用過的物體。
Q29: APP轉基因小鼠在實驗中會無故死亡么？
A: AD轉基因小鼠本來死亡率就高于同窩野生型，比如APPPS1δ9一般準備試驗用鼠時雜合子就要比野生型多準備20%，注意AD小鼠最初開發(fā)時幾篇原文中的生存曲線，具體到不同的AD鼠略有不同，請根據自己所選擇的AD鼠查詢文獻或者咨詢供貨商。
Q30: 行為學軟件分析目前做到什么水平了？
A: AnyMaze和Nudols都是很好的行為學分析軟件，主要是分析迷宮類視頻中的實驗數據，攝像設備的設置和動物環(huán)境對比是很重要的準備工作，具體官方網站有詳細介紹。國產也有很多，功能大同小異，只是具體動物運動識別能力可能會根據算法的差異存在區(qū)別。
Q31: 新物體識別，現在有統(tǒng)計20s閾值內探索時？
A: 問題貌似沒問全，兩個物體一共探索20秒就停止實驗，不過一般會設定探索時間上限，比如10分鐘內沒有探索到20s的小鼠就不計入統(tǒng)計。
Q32: 3xTg AD模型，NFT怎么染色，有成熟的方案或者試劑盒嗎？
A: 有P-tau的抗體。具體見https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=MAPT#proteins.
Q33: 還想問問Y迷宮不是從同一條壁放的有影響嗎？
A: 無論是對自主交替這種無需饑餓誘導的實驗還是對檢測短時工作記憶的饑餓誘導實驗來說，嚴格的話本來就是應該從不同的臂放入去平衡不同臂可能帶來的差異。
溫馨提示
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