基于SDHB突變自發(fā)PC/PG腫瘤的大鼠模型及腫瘤細胞的建立及意義

 

副神經節(jié)瘤（paraganglioma, PG）和嗜鉻細胞瘤（pheochromocytoma, PC）都是在自主神經系統(tǒng)中嗜鉻細胞中發(fā)生的腫瘤。目前研究表明PG/PC遺傳因素占40%，其中琥珀酸脫氫酶亞單位SDHB造成的PC/PD的惡性程度是最高的，達到了38%-83%。然而目前對于惡性的PG/PC沒有有效的治療方法，并且，目前還沒有琥珀酸脫氫酶（Succinate Dehydrogenase，SDH）突變的PC/PG完善模型。近期，有研究人員新研發(fā)了兩種基于SDHB突變自發(fā)PC/PG腫瘤的大鼠模型及相應的腫瘤細胞系，為PC/PG腫瘤的研究提供更好的的動物模型。

 

背景介紹

 

PG和 PC都是在自主神經系統(tǒng)中嗜鉻細胞中發(fā)生的腫瘤。從這個定義來看，副神經節(jié)瘤好像歸屬于嗜鉻細胞瘤一樣，但其實二者是并列關系，主要區(qū)別在于腫瘤起源的部位。嗜鉻細胞瘤被定義為起源于腎上腺髓質的嗜鉻細胞腫瘤，而副神經節(jié)瘤的起源則為腎上腺之外。PC多數情況下具有兒茶酚胺功能活性，而PG這種情況比較少見，由于都是自主神經系統(tǒng)發(fā)生了腫瘤且有過量的兒茶酚胺（catecholamine）產生，因此這兩種腫瘤的癥狀常常是共通的，如頭痛、出汗、心率加快、焦慮、高血壓、顫抖、反胃和體重降低等。雖然總體而言此類腫瘤患病率不算很高，大約為1/300000左右，也并非胰腺癌一樣診斷即“死刑”的惡性腫瘤，但放任不管肯定會大大提高其轉移和惡性化的風險，此外其癥狀也會嚴重影響患者的生活，因此，對其研究和藥物開發(fā)也必須予以高度重視。

 

目前研究表明PG/PC遺傳因素占40%，并且和其他的腫瘤一樣，年齡的增長也會使其發(fā)病率提高。很多基因的突變會與PG/PC產生聯系，如琥珀酸脫氫酶（DH）亞基SDHB，SDHC 和SDHD ，它們的突變占據了家族性PG/PC的多數, 其中SDHB更是其中的“頂梁柱”，除了上述SDH基因外, 其他與PG/PC相關的基因還有RET、SDHAF2、VHL、NF1、TMEM127、MAX和 SLC25A11等。

 

圖1. 副神經節(jié)瘤和嗜鉻細胞瘤[1]

 

SDHA、SDHB、SDHC和SDHD共同構成線粒體內膜呼吸鏈上的復合體2（Respiratory Complex II，RC2）。而RC2也是唯一一個同時兼職三羧酸循（Tricarboxylic Acid Cycle，TAC）環(huán)和電子傳遞鏈（Electron transport chain）的重要蛋白復合物。

 

這四個亞基中SDHA和SDHB位于基質中，作為催化功能單位存在；而SDHC和SDHD則嵌入在線粒體內膜中，負責錨定整個RC2。進一步細分的話，SDHA將琥珀酸轉化成延胡索酸（fumarate），同時FAD轉化成了FADH2；SDHB接受FADH2的電子，并將電子通過SDHC/SDHD傳遞給輔酶Q（ubiquinone），從而完成RC2的功能。哺乳動物的琥珀酸脫氫酶除了能量代謝，氧化環(huán)境感知這種本職工作之外，也是重要的抑癌蛋白，它們功能失常會導致腫瘤的發(fā)生。如前文所述，RC2四個亞基中的三個都與遺傳性PG/PC有著密切的關系。尤其是SDHB，其突變造成的PC/PD的惡性程度是最高的，達到了38%-83%，而SDHD突變造成的PG/PC基本為良性，散發(fā)性PG/PC惡性率也低于10%。

 

目前對于惡性的PG/PC沒有有效的治療方法，并且，目前還沒有SDH突變的PC/PG完善模型，基于這個原因，開發(fā)一種基于SDHB突變的自發(fā)PC/PG腫瘤動物以及相應腫瘤細胞系將對該腫瘤的機理研究和藥物臨床前研發(fā)提供很大的幫助。

 

圖2. SDHB的功能[2]

 

對新構建的SDHB雜合敲除大鼠進行表達驗證

 

與小鼠或其他物種相比，大鼠有很高的概率自發(fā)形成PC和PG（不過PC發(fā)生的概率比PG高）。在野生型SD大鼠中，最早12月齡就可以自發(fā)形成PC，到了24月齡時，PC的患病率可以達到10%，并且還可以人為通過高能量食物，輻照，藥物以及激素刺激等方法增加PC的發(fā)病率。因此，利用大鼠的這一特性開發(fā)SDHB相關的PG/PC腫瘤細胞模型會是一個不錯的選擇。

 

研究人員委托賽業(yè)生物科技公司用TALEN（transcription activator-like effector nuclease）技術構建了4種SDHB堿基缺失情況不同的大鼠，結果有3種突變成功地遺傳繁育下來。對構建好的SDHB缺失大鼠模型進行驗證，發(fā)現在轉錄層面，Sdhb+/-大鼠肝臟的SDHB表達正好相當于野生型的50%左右，而蛋白表達則為野生型的68%。而且Sdhb+/-線粒體復合體2的活性也只有野生型的一半了。上述結果說明將SDHB的表達和活性減弱的目的已經達到。

 

將Sdhb+/-與Sdhb+/-進行交配，可以看到有1/4的胚胎致死率（正好符合純合Sdhb-/-所占比例），所以用來后續(xù)構建腫瘤模型的大鼠只能是雜合子。這說明SDHB對于動物的存活是必須的。經過多次嘗試，兩種能夠進行無限連續(xù)移植的PC腫瘤的大鼠脫穎而出。它們都是經過輻照的大鼠，分別命名為RS0和RS1/2。這兩種大鼠以及由其PC/PG腫瘤培養(yǎng)而來的腫瘤細胞系將成為后續(xù)研究的主角。

 

圖3. Sdhb+/-大鼠SDHB的表達及SDHB缺失造成的影響[3]

 

SDHB缺失造成的病理改變

 

如果僅僅是SDHB基因的表達和RC2復合體活性發(fā)生改變，還不能成為理想的模型。需要進一步的組織形態(tài)驗證。免疫組化實驗發(fā)現RS0經過HE染色后有明顯的Zellballen結構（這種結構是PC/PG腫瘤組織的重要特征），有著更清晰的血管結構和細胞結構，和人類PG的形態(tài)也非常相似。而RS1/2的細胞則更加彌散。在SDHB和SDHA的染色方面，可以看到RS0的SDHB表達顯著低于RS1/2，而SDHA二者都有較高的表達。酪氨酸羥化酶（TH）的染色則是RS1/2更為彌散。總之RS0在病理表型上展現出了多項PC/PG的特征。

 

不過這里卻留給人一個疑問，那就是為什么同是由SDHB雜合子發(fā)生了PC/PG的大鼠組織，RS0和RS1/2之間會有如此大的區(qū)別呢？尤其是理論上基因型一致的兩種大鼠，為什么SDHB的表達差異如此之大。不要急，待到后面講到全基因組測序（WGS）的時候會公布答案。

 

圖4. 大鼠異種移植PC/PG腫瘤病理結果展示[3]

 

大鼠PG/PC腫瘤細胞內結構特點

 

剛才觀察的是組織層面的表型，如果我們將視野用電鏡聚焦到細胞內，那么可以看到RS0較于RS1/2神經內分泌顆粒（secretory granules，箭頭所示）的分布更加彌散，細胞質液泡更大更多（v），這與SDH缺陷的人腫瘤細胞非常類似。另一方面，RS0細胞也與以前的SDH缺陷導致的胃間質瘤一樣出現了線粒體細長的現象。與組織層面的結果類似，因此相較于RS1/2，RS0在很多方面都與人的SDH缺陷腫瘤組織具有更為接近的表型。

 

圖5. 大鼠異種移植PC/PG腫瘤細胞內結構展示[3-5]

 

可傳代PC/PG細胞系的獲得

 

表型有了，下一步就是要將腫瘤細胞培養(yǎng)成能夠無限傳代方便保存的細胞系了。如果用常規(guī)RPMI培養(yǎng)液（Roswell Park Memorial Institute Medium）加入10%馬血清和5%胎牛血清，并將細胞置于5%氧氣培養(yǎng)箱中，RS0細胞的細胞質內會很快產生并聚集液泡進而造成細胞在2周左右死亡；而RS1/2細胞在同樣的條件下則不會產生液泡，并可以存活數月，只不過細胞體積會隨著細胞接近死亡而緩慢減小。為了讓RS0細胞“升級”成細胞系，需要進一步改變培養(yǎng)條件，通過降低血清濃度并降低培養(yǎng)箱含氧量，同時在培養(yǎng)液中加入促干細胞因子，經過多次嘗試后，終于培養(yǎng)得到了RS0細胞系。在無血清條件下，RS0能夠脫壁懸浮生長并能聚集成細胞團。通過BRDU（檢測DNA復制）染色（黑色）可以觀察到聚集成團的細胞仍然處于不斷增生的狀態(tài)之中。至此，PC/PG細胞系宣告構建成功，接下來要做的就是進行分子水平的驗證了。

 

圖6. 可傳代細胞系的表型[3]

 

腫瘤和細胞系的全基因組測序（WGS）

 

為了進一步明確RS0和RS1/2細胞系在基因層面發(fā)生了怎樣的改變，作者對兩種細胞系進行了全基因組測序，并與其來源大鼠的正常組織進行了對比。

通過將SDHB外顯子1及其上游一共1.4k左右的片段進行比對，發(fā)現了RS0細胞系保留了因基因編輯造成的sdhb第1外顯子上的13個堿基缺失去，同時還有sdhb基因上游啟動子前729bp的丟失，而且與RS0大鼠不同的是，RS0細胞系中的這兩處改變都是純合的，這可能是RS0腫瘤表型明顯的原因之一。另一方面RS1/2大鼠來源的腫瘤細胞系則發(fā)生了相反的改變，其13bp的缺失恢復成了野生型。

 

圖7. 全基因組測序分析[3]

 

代謝和蛋白表達炎癥

 

為了進一步確定RS0和RS1/2兩種腫瘤的特征，需要繼續(xù)對RS0和RS1的代謝物進行檢測。結果發(fā)現兩種腫瘤細胞的琥珀酸鹽都發(fā)生了嚴重的積累（紅框）；乳糖（綠框）或谷氨酸（藍框）的積累也和SDH相關的人源腫瘤細胞的情況非常類似。如果想用RS0進行PG研究，可以發(fā)現RS0具有SDH缺乏型PG的高多巴胺表達，極低的去甲腎上腺素和腎上腺素表達。因此在代謝方面RS0也對PC/PG進行了很好的還原。

 

HIF2A（Hypoxia Inducible Factor 2 Alpha, EPAS1）的通路發(fā)生改變是SDHB突變的遺傳性癌癥的重要特征，于是在分子方面，作者也對這條信號通路相關RNA和蛋白的表達進行了驗證，RNASeq的結果表明HIF2A本身及其下游的Vegfa（Vascular endothelial growth factor A）表達都有10倍以上顯著升高。

 

使用PC12細胞（常用的神經細胞株，SDHB正常）和大鼠甲狀腺髓質細胞（Rat Adrenal Medullas, RAM）細胞作為對照，一次性比較腫瘤和細胞系之間基因表達的差異。如果對自發(fā)腫瘤進行比較，相較于shdb+/-，sdhb-/-細胞HIF1A的表達提高，SDHB自身的表達降低。如果對各自細胞系與自發(fā)腫瘤進行比較，在RS0自發(fā)腫瘤中SDHB高表達的情況下則可以發(fā)現RS0細胞系中SDHB的完全消失，這與WGS的結果一致，進一步說明RS0細胞系與RS0自發(fā)腫瘤的差別。但有意思的是，RS1/2組織中的HIF2A的表達遠低于RS0，這種情況在各自細胞系中則發(fā)生了逆轉，RS1/2細胞系中HIF2A的表達顯著高于RS0中。至此，論文已經部分完成了對新建大鼠SDHB相關PC/PG自發(fā)腫瘤和細胞系的構建和驗證。

 

圖8. 腫瘤移植物的代謝和表達驗證[3]

 

總結

 

本研究主要有以下三點貢獻：

1. 開發(fā)了兩種基于SDHB突變的自發(fā)PC/PG大鼠可移植腫瘤

2. 開發(fā)了兩種具有不同PC/PG特征（SDHB缺陷和非SDHB缺陷）的腫瘤細胞系

3. 提供了低氧，低血清（或無血清）和干細胞誘導因子結合的腫瘤細胞系構建思路

 

作者同時為人們提供了可以遺傳的自發(fā)PC/PG大鼠用于活體腫瘤研究，也提供了便于操作的PC/PG細胞系，能為以后針對SDH突變的PC/PG研究提供了很大的便利。有意思的是，過往的SDHB抑制腫瘤模型和細胞系構建的失敗一方面可能是由于太過“純凈”的SDHB敲除而缺乏由于輻照或其他未知原因引起的基因改變；另一方面也可能是過于執(zhí)著于用小鼠建模，而忽視了更易構建PC/PG模型的大鼠。同時RS0和RS1/2兩種不同類型的PC/PG大鼠和細胞系也同時涵蓋了SDHB缺失和SDHB表達正常的兩種狀態(tài)，可以使后續(xù)的研究更加精細化，類似于PDX的大鼠自發(fā)腫瘤更適合用于臨床前藥物研究，而細胞系則可以在機理的研究中大顯身手。相信在不久的未來就能在嗜鉻細胞瘤和副神經節(jié)瘤的研究過程中發(fā)現這些重要模型的身影。

 

參考文獻：

1.https://www.cancer.gov/types/pheochromocytoma/patient/pheochromocytoma-treatment-pdq

2.https://en.wikipedia.org/

3.Powers JF,Cochran B,Baleja JD et, al. A xenograft and cell line model of SDH-deficient pheochromocytoma derived from Sdhb+/- rats[J]. Endocr Relat Cancer 2020

4.Powers J F , Brent C , Baleja J D , et al. A unique model for SDH-deficient GIST: an endocrine-related cancer[J]. Endocrine Related Cancer, 2018:ERC-18-0115-.

5.Szarek E , Ball E R , Imperiale A , et al. Carney triad, SDH-deficient tumors, and Sdhb+/- mice share abnormal mitochondria[J]. Endocrine Related Cancer, 2015, 22(3):345-352.