腫瘤學(xué)必備——血管生成實驗介紹

瀏覽次數(shù)：4959　發(fā)布日期：2019-3-11　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負

實驗原理
腫瘤血管生成是一個極其復(fù)雜的過程，一般包括包括血管內(nèi)皮基質(zhì)降解、內(nèi)皮細胞移行、內(nèi)皮細胞增殖、內(nèi)皮細胞管道化分支形成血管環(huán)和形成新的基底膜等步驟。無論原發(fā)性腫瘤還是繼發(fā)性腫瘤，一旦生長直徑超過1~2 mm，都會有血管生成。這是由于腫瘤細胞自身可分泌多種生長因子，誘導(dǎo)血管生成。多數(shù)惡性腫瘤的血管生成密集且生長迅速。因此，血管生成在腫瘤的發(fā)展轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用，抑制這一過程將能明顯阻止腫瘤組織的發(fā)展和擴散轉(zhuǎn)移。
體外的血管生成實驗能很好的模擬腫瘤的血管發(fā)生過程，并且適合研究藥物對這一過程的影響實驗。我們以HUVEC細胞為例，介紹這一實驗的詳細過程。

圖一血管生成鏡檢圖

一. 實驗材料和實驗方法
1. 實驗材料

2. 實驗方法：
2.1 實驗流程介紹

圖二實驗流程圖

（提前將Matrigel融化，鋪于ibidi血管生成載玻片的下孔中，待膠凝后，將細胞懸液加入血管生成載玻片上孔中，成管后使用顯微鏡觀察。）
2.2 耗材結(jié)構(gòu)介紹

圖三血管生成載玻片縱截面示意圖
（Matrigel鋪在下孔，細胞鋪在Matrigel上，上孔充滿培養(yǎng)基）

2.3 數(shù)據(jù)分析流程介紹

圖四實驗結(jié)果收集和分析流程圖
（在特定的時間點采集圖片，并且進行圖像分析（Wimasis全自動分析）測量小管長度，成環(huán)數(shù)，細胞覆蓋面積和結(jié)點。之后在對測量結(jié)果進行統(tǒng)計分析以說明實驗結(jié)果。）
二. 實驗步驟
1. 準備基質(zhì)膠
1）.實驗前一天將Matrigel置于冰盒中，放入4。C冰箱，使膠能過夜緩慢融化。（注意：同樣要準備一些4。C預(yù)冷的槍頭用于吸取Matrigel）
2）.開始實驗前，將Matrigel始終保持放在冰盒中。
3）.打開滅菌包裝，取出ibidi血管生成載玻片。
4）.每孔中加入10μl Matrigel。注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠。

由于Matrigel流動性不強，并且有可能移液槍不準確，有可能打入10μl的膠，卻不能填滿血管生成載玻片的下孔——這樣，必然會影響到實驗的成像結(jié)果。
如何判斷是否加入了合適體積的Matrigel：
我們只需用一張格子紙就能知道自己的移液槍調(diào)整到多少能正好把下孔填滿。

如上圖所示，垂直透過每個孔看下面的格子紙，如果格子被縮小了，那么就說明膠沒加滿，格子被放大了，那么膠就加多了，格子沒發(fā)生什么變形，這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。
2. 凝膠
1）.蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。
2）.準備一個10cm的培養(yǎng)皿，放入浸過水的紙巾，制成一個濕盒。
3）.將ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋。
4）.將整個培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，靜置30分鐘左右，等待膠凝結(jié)。
5）.等待同時準備細胞懸液。

3. 鋪細胞
加入細胞的量直接影響實驗結(jié)果，所以在正式實驗開始之前，要對不同類型的細胞和使用數(shù)量進行預(yù)實驗。獲得最佳比例的細胞密度。我們今天的實驗使用HUVEC細胞，每孔種10000個細胞即可。
1）.準備密度為2*105cells/ml的細胞懸液，充分混勻。
2）.將膠已經(jīng)凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。
3）.每孔加入50μl的細胞懸液，注意保持槍頭垂直在上孔的上方，不要接觸下孔的凝膠。可以使用排槍。
4）.同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體，如果沒有，加入無細胞的培養(yǎng)基，使上孔液體正好加滿。
5）.蓋上蓋，靜置，一段時間后，所有細胞都會沉下去落在Matrigel的表面。

4. 采集圖像并統(tǒng)計結(jié)果
可以按照細胞的生長速度定時采集圖像，并且對其成管長度，覆蓋面積，成環(huán)數(shù)，結(jié)點數(shù)進行測量和記錄，并且對其進行統(tǒng)計分析。

5. 免疫熒光染色
根據(jù)需要，可以對成管結(jié)果進行免疫熒光染色。
1）.小心的移除上孔內(nèi)培養(yǎng)基，注意不要碰到膠或者細胞網(wǎng)絡(luò)。
2）.加入50μl用無血清培養(yǎng)基稀釋的calcein (12.5 µl calcein stock 1 µg/µl)，使其終濃度為 6.25 µg/ml (1:160)。
3）.在室溫下避光孵育30分鐘。
4）.使用PBS清洗三次，注意，PBS要緩緩加入上孔，以免沖擊掉細胞。
5）.使用 485 nm/ 529 nm進行免疫熒光成像。